Bestemmelse af toksiciteten af UV-stråling og kemikalier på primære og udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller

Summary

Denne artikel beskriver de procedurer, der anvendes til at evaluere toksiciteten af UV-stråling og kemiske toksiner på en primær og udødeliggjort cellelinje.

Abstract

Denne artikel beskriver metoderne til måling af toksiciteten af ultraviolet (UV) stråling og okulære toksiner på primære (pHCEC) og udødeliggjorte (iHCEC) humane hornhindeepitelcellekulturer. Celler blev udsat for UV-stråling og toksiske doser af benzalkoniumchlorid (BAK), hydrogenperoxid (_H2O2) og natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolisk aktivitet blev målt ved hjælp af et metabolisk assay. Frigivelsen af inflammatoriske cytokiner blev målt ved anvendelse af et multi-plex interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 og tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) assay, og celler blev evalueret for levedygtighed ved anvendelse af fluorescerende farvestoffer.

De skadelige virkninger af UV på cellemetabolisk aktivitet og cytokinfrigivelse forekom ved 5 minutters UV-eksponering for iHCEC og 20 minutter for pHCEC. Lignende procentvise fald i metabolisk aktivitet af iHCEC og pHCEC opstod efter eksponering for BAK,_H2O2eller SDS, og de mest signifikante ændringer i cytokinfrigivelse forekom for IL-6 og IL-8. Mikroskopi af fluorescerende farvede iHCEC- og pHCEC BAK-eksponerede celler viste celledød ved 0,005% BAK-eksponering, selvom graden af ethidiumfarvning var større i iHCEC’erne end pHCEC’erne. Ved hjælp af flere metoder til vurdering af toksiske virkninger ved hjælp af mikroskopi, vurderinger af metabolisk aktivitet og cytokinproduktion kunne toksiciteten af UV-stråling og kemiske toksiner bestemmes for både primære og udødeliggjorte cellelinjer.

Introduction

In vitro toksikologiundersøgelser udføres for at forudsige de toksiske virkninger af kemikalier og andre stoffer, der kan forårsage skade på celler. Ved vurderingen af toksicitet for hornhinden er humane hornhindeepitelceller (HCEC) blevet anvendt i modeller til evaluering af disse virkninger 1,2,3,4. Disse modeller evaluerer typisk fysiologiske effekter såsom ændringer i cellens metaboliske aktivitet, celleproliferation og andre cellefunktioner såsom produktion og frigivelse af inflammatoriske cytokiner. Til disse toksikologiundersøgelser er celler fra forskellige kilder blevet udvalgt til at vurdere kemikaliers og UV-strålings skadelige virkninger på HCECs ^2,3. pHCEC-linjer er tilgængelige fra virksomheder, der leverer disse celler fra donorvæv hos voksne. Primære celler kan behandles med dispase og forsigtigt skrabes af hornhinden til dyrkning⁵. Cellerne testes derefter for virus og kontaminering og sendes derefter kryopræserveret i 10% dimethylsulfoxid.

Fordelen ved primære cellelinjer er, at cellerne er genetisk identiske med donorens celler. Dette er ideelt, da en in vitro-model skal efterligne in vivo-vævet så meget som muligt. Ulempen ved primære cellelinjer er, at de har et begrænset antal celledelinger eller passager⁶. Det begrænsede antal celler, der er til rådighed, begrænser antallet af eksperimenter, der kan udføres med en enkelt primærkultur, hvilket øger omkostningerne ved eksperimenterne.

Udødeliggjorte cellelinjer er også blevet anvendt i cellekultur toksicitetsmodeller. I modsætning til den primære cellelinje opnået fra in vivo-væv er den udødeliggjorte cellelinje imidlertid blevet genetisk ændret. Udødeliggjorte celler skabes ved at inkorporere generne fra en virus i DNA’et i primære celler ^6,7,8. Celler med vellykket viral geninkorporering vælges til den udødeliggjorte cellelinje. Fordelen ved udødeliggørelse er, at det giver mulighed for ubestemt hurtig spredning, hvilket giver et ubegrænset antal celler til at udføre flere eksperimenter ved hjælp af den samme cellelinje. Dette giver mulighed for konsistens mellem eksperimenter og reducerer omkostningerne.

Ud over ændringer i generne, der begrænsede celleproliferationen, kunne der også forekomme ændringer i ekspressionen af gener med kritisk funktionalitet⁹. Derfor er ulempen ved at bruge udødeliggjorte celler, at de muligvis ikke længere repræsenterer de originale in vivo-celler med hensyn til deres reaktion på forskellige eksterne stimuli¹⁰. Sammenligninger har involveret observation af kemikaliers toksiske virkninger på primære og udødeliggjorte humane hornhindekeratocytter¹¹ samt udødeliggjorte HCEC’er og kaninhornhindepitelprimærceller¹². Sammenligningen mellem toksiners virkninger på primære humane keratocytter og udødeliggjorte keratocytter viste ingen signifikante forskelle¹¹. Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne artikel, bestemmes effektiviteten af disse assays til vurdering af toksiciteten af UV-stråling og okulære toksiner på pHCEC’er og iHCEC’er.

Tre okulære toksiner, der almindeligvis anvendes i in vitro-assays, blev udvalgt: BAK,_H2O2og SDS. BAK er et kationisk konserveringsmiddel, der almindeligvis anvendes i oftalmiske opløsninger 13,14,_H2O2bruges almindeligvis til at desinficere kontaktlinser 15, og SDS er et anionisk overfladeaktivt middel^, der findes i vaskemidler og shampoo ¹⁴. I lighed med okulære toksiner kan UV-stråling også forårsage betydelig skade på HCEC’er³. Derudover kan overeksponering for UV forårsage en okulær tilstand kendt som fotokeratitis karakteriseret ved symptomer på rive, lysfølsomhed og en følelse af grynhed¹⁶.

Der er et ubegrænset antal primære cellekulturer, der kan bruges, og forskellige udødeliggjorte cellelinjer, der er blevet udviklet. Derfor blev der foretaget en undersøgelse for at sammenligne primære HCEC’er med en udødeliggjort HCEC-linje for at bestemme ligheder og forskelle mellem modeller, der inkorporerer disse typer celler.

Denne undersøgelse brugte mikroskopi til at vurdere mulige forskelle mellem pHCEC’er og iHCEC’er på cellefysiologisk respons på UV og toksiner. Virkningerne af UV-stråling og kemikalier på cellemetabolisk aktivitet og inflammatorisk cytokinfrigivelse for de to cellelinjer blev også evalueret. Vigtigheden af at bestemme forskellene mellem de to cellelinjer er at forstå den optimale anvendelse af disse cellelinjer til evaluering: 1) effekten af UV-stråling på celler, 2) virkningerne af toksiner på celler og 3) de resulterende ændringer i metabolisme, cellelevedygtighed og cellecytokinfrigivelse til fremtidige undersøgelser.

Protocol

1. Dyrkning af pHCEC’er og iHCEC’er Dyrk pHCEC’erne og iHCEC’erne i humant okulært epitelmedium (HOEM) med følgende kosttilskud: 6 mM L-glutamin, 0,002% cellemedietilskud O (materialefortegnelse), 1,0 μM adrenalin, 0,4% cellemedietilskud P (materialetabel), 5 μg / ml rh-insulin, 5 μg / ml apo-transferrin og 100 ng / ml hydrocortisonhemisuccinat i kollagen-1-belagte kulturkolber (18 ml i en 75 cm2 kulturkolbe). Skift mediet i kolberne hver 2-3 dage ved …

Representative Results

CellestørrelseDe primære og udødeliggjorte HCEC’er blev visualiseret med tre fluorescerende farvestoffer, som afspejler tre forskellige stadier af cellelevedygtighed. Levende celler er grønne (calcein-AM), døde celler er røde (ethidium homodimer-1), og apoptotiske celler er gule (annexin V-computerjusteret farve for bedre visualisering af fluorescenssignalet). Levende celler indeholder esteraser i cellecytoplasmaet og konverterer calcein-AM til calcein. Døde celler har cellemembraner, der er g…

Discussion

Potentielle forskelle i anvendelsen af to typer HCEC’er blev vurderet. Celler blev placeret i samme medium (HOEM) i identiske koncentrationer af celler og derefter udsat for korte og lange perioder med UV-stråling og tre okulære toksiner. Doser af UV-stråling og kemikalier blev valgt ud fra deres fysiologiske virkninger, som var skadelige nok for cellerne til at producere mellemliggende reaktioner, der kunne sammenlignes. Eksponeringstider på 5 og 20 minutter for UV-stråling og 5 og 15 minutter for de udvalgte doser…

Materials

75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036