Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Bewertung der Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen auf einer primären und immortalisierten Zelllinie.
Abstract
Dieser Artikel beschreibt die Methoden zur Messung der Toxizität von ultravioletter (UV) Strahlung und Augentoxinen auf primären (pHCEC) und immortalisierten (iHCEC) humanen Hornhautepithelzellkulturen. Die Zellen wurden UV-Strahlung und toxischen Dosen von Benzalkoniumchlorid (BAK), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Natriumdodecylsulfat (SDS) ausgesetzt. Die metabolische Aktivität wurde mit einem metabolischen Assay gemessen. Die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen wurde mit einem Multiplex-Interleukin (IL)-1β-, IL-6-, IL-8- und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Assay gemessen, und die Zellen wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen auf ihre Lebensfähigkeit untersucht.
Die schädigenden Auswirkungen von UV-Strahlung auf die Stoffwechselaktivität und die Freisetzung von Zytokinen traten bei 5 min UV-Exposition für iHCEC und 20 min für pHCEC auf. Ähnliche prozentuale Abnahmen der metabolischen Aktivität von iHCEC und pHCEC traten nach Exposition gegenüber BAK,H2O2 oder SDS auf, und die signifikantesten Veränderungen in der Zytokinfreisetzung traten für IL-6 und IL-8 auf. Die Mikroskopie von fluoreszenzgefärbten iHCEC- und pHCEC-BAK-exponierten Zellen zeigte den Zelltod bei 0,005% BAK-Exposition, obwohl der Grad der Ethidiumfärbung bei den iHCECs größer war als bei pHCECs. Unter Verwendung mehrerer Methoden zur Beurteilung toxischer Wirkungen mittels Mikroskopie, Bewertung der Stoffwechselaktivität und Zytokinproduktion konnte die Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen sowohl für primäre als auch für immortalisierte Zelllinien bestimmt werden.
Introduction
In-vitro-toxikologische Studien werden durchgeführt, um die toxischen Wirkungen von Chemikalien und anderen Wirkstoffen vorherzusagen, die Zellen schädigen können. Bei der Bewertung der Toxizität für die Hornhaut wurden humane Hornhautepithelzellen (HCECs) in Modellen zur Bewertung dieser Effekte verwendet 1,2,3,4. Diese Modelle bewerten in der Regel physiologische Effekte wie Veränderungen der Stoffwechselaktivität der Zelle, Zellproliferation und andere Zellfunktionen wie die Produktion und Freisetzung von entzündlichen Zytokinen. Für diese toxikologischen Studien wurden Zellen aus verschiedenen Quellen ausgewählt, um die schädlichen Auswirkungen von Chemikalien und UV-Strahlung auf HCECs zu bewerten 2,3. pHCEC-Linien sind von Unternehmen erhältlich, die diese Zellen aus Spendergewebe von Erwachsenen liefern. Primärzellen können mit Dispase behandelt und für die Kultur schonend von der Hornhaut abgekratzt werden5. Die Zellen werden dann auf Viren und Verunreinigungen getestet und dann kryokonserviert in 10% Dimethylsulfoxid verschickt.
Der Vorteil von primären Zelllinien besteht darin, dass die Zellen genetisch identisch mit den Zellen des Spenders sind. Dies ist ideal, da ein In-vitro-Modell das In-vivo-Gewebe so weit wie möglich nachahmen sollte. Der Nachteil von primären Zelllinien besteht darin, dass sie eine begrenzte Anzahl von Zellteilungen oder -passagenaufweisen 6. Die begrenzte Anzahl der verfügbaren Zellen schränkt die Anzahl der Experimente ein, die mit einer einzigen Primärkultur durchgeführt werden können, was die Kosten der Experimente erhöht.
Immortalisierte Zelllinien wurden auch in Toxizitätsmodellen für Zellkulturen verwendet. Im Gegensatz zur primären Zelllinie, die aus In-vivo-Gewebe gewonnen wird, wurde die immortalisierte Zelllinie jedoch genetisch verändert. Immortalisierte Zellen entstehen, indem die Gene eines Virus in die DNA von Primärzellen eingebautwerden 6,7,8. Zellen mit erfolgreicher viraler Geninkorporation werden für die immortalisierte Zelllinie ausgewählt. Der Vorteil der Immortalisierung besteht darin, dass sie eine unbegrenzte schnelle Proliferation ermöglicht und eine unbegrenzte Anzahl von Zellen zur Verfügung stellt, um mehrere Experimente mit derselben Zelllinie durchzuführen. Dies ermöglicht Konsistenz zwischen den Experimenten und senkt die Kosten.
Zusätzlich zu den Veränderungen in den Genen, die die Zellproliferation einschränken, können auch Veränderungen in der Expression von Genen mit kritischer Funktionalität auftreten9. Der Nachteil der Verwendung von immortalisierten Zellen besteht daher darin, dass sie in Bezug auf ihre Reaktion auf verschiedene äußere Reize möglicherweise nicht mehr die ursprünglichen In-vivo-Zellen darstellen10. Bei den Vergleichen wurden die toxischen Wirkungen von Chemikalien auf primäre und immortalisierte menschliche Hornhautkeratozyten11 sowie auf immortalisierte HCECs und Kaninchen-Hornhautepithel-Primärzellen12 beobachtet. Der Vergleich zwischen den Effekten von Toxinen auf primäre humane Keratozyten und immortalisierte Keratozyten zeigte keine signifikanten Unterschiede11. Mit den in diesem Artikel beschriebenen Methoden wird die Wirksamkeit dieser Assays zur Beurteilung der Toxizität von UV-Strahlung und Augentoxinen auf pHCECs und iHCECs bestimmt.
Es wurden drei okuläre Toxine ausgewählt, die üblicherweise in In-vitro-Assays verwendet werden: BAK,H2O2und SDS. BAK ist ein kationisches Konservierungsmittel, das häufig in ophthalmologischen Lösungen verwendet wird 13,14,H2O2wird häufig zur Desinfektion von Kontaktlinsen 15 verwendet, und SDS ist ein anionisches Tensid, das in Waschmitteln und Shampoos 14 vorkommt. Ähnlich wie Augentoxine kann auch UV-Strahlung HCECs erheblich schädigen3. Darüber hinaus kann eine übermäßige UV-Strahlung eine Augenerkrankung verursachen, die als Photokeratitis bekannt ist und durch Symptome wie Tränenfluss, Lichtempfindlichkeit und ein Gefühl der Körnigkeit gekennzeichnet ist16.
Es gibt eine unbegrenzte Anzahl von primären Zellkulturen, die verwendet werden können, und verschiedene immortalisierte Zelllinien, die entwickelt wurden. Daher wurde eine Untersuchung durchgeführt, um primäre HCECs mit einer immortalisierten HCEC-Linie zu vergleichen, um Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Modellen zu ermitteln, die diese Zelltypen enthalten.
Diese Untersuchung nutzte die Mikroskopie, um mögliche Unterschiede zwischen pHCECs und iHCECs in Bezug auf die physiologische Reaktion der Zellen auf UV-Strahlung und Toxine zu bewerten. Die Auswirkungen von UV-Strahlung und Chemikalien auf die Zellstoffwechselaktivität und die inflammatorische Zytokinfreisetzung für die beiden Zelllinien wurden ebenfalls untersucht. Die Bedeutung der Bestimmung der Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien besteht darin, die optimale Verwendung dieser Zelllinien für die Bewertung zu verstehen: 1) die Wirkung von UV-Strahlung auf Zellen, 2) die Auswirkungen von Toxinen auf Zellen und 3) die daraus resultierenden Veränderungen des Stoffwechsels, der Zelllebensfähigkeit und der Zellzytokinfreisetzung für zukünftige Studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mögliche Unterschiede in der Verwendung von zwei Arten von HCECs wurden bewertet. Die Zellen wurden in das gleiche Medium (HOEM) mit identischen Zellkonzentrationen eingebracht und dann kurzen und langen Perioden von UV-Strahlung und drei Augentoxinen ausgesetzt. Die Dosen von UV-Strahlung und Chemikalien wurden auf der Grundlage ihrer physiologischen Wirkungen ausgewählt, die für die Zellen schädlich genug waren, um Zwischenreaktionen hervorzurufen, die verglichen werden konnten. Expositionszeiten von 5 und 20 min f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erhielten für diese Arbeit keine Förderung.
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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