Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate

Summary

Questo articolo descrive le procedure utilizzate per valutare la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche su una linea cellulare primaria e immortalata.

Abstract

Questo articolo descrive i metodi per misurare la tossicità delle radiazioni ultraviolette (UV) e delle tossine oculari su colture di cellule epiteliali corneali umane primarie (pHCEC) e immortalizzate (iHCEC). Le cellule sono state esposte a radiazioni UV e dosi tossiche di benzalconio cloruro (BAK), perossido di idrogeno(H 2 O₂) e sodio dodecilsolfato (SDS). L’attività metabolica è stata misurata utilizzando un test metabolico. Il rilascio di citochine infiammatorie è stato misurato utilizzando un test multi-plex di interleuchina (IL)-1β, IL-6, IL-8 e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e le cellule sono state valutate per la vitalità utilizzando coloranti fluorescenti.

Gli effetti dannosi dei raggi UV sull’attività metabolica cellulare e sul rilascio di citochine si sono verificati a 5 minuti di esposizione ai raggi UV per iHCEC e 20 minuti per pHCEC. Simili cali percentuali nell’attività metabolica di iHCEC e pHCEC si sono verificati dopo l’esposizione a BAK, H 2 O₂o SDS e i cambiamenti più significativi nel rilascio di citochine si sono verificati per IL-6 e IL-8. La microscopia delle cellule esposte a iHCEC e pHCEC BAK colorate con fluorescenza ha mostrato la morte cellulare con un’esposizione BAK dello 0,005%, sebbene il grado di colorazione dell’etidio fosse maggiore negli iHCEC rispetto ai pHCEC. Utilizzando molteplici metodi di valutazione degli effetti tossici mediante microscopia, valutazioni dell’attività metabolica e produzione di citochine, la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche potrebbe essere determinata sia per le linee cellulari primarie che per quelle immortalate.

Introduction

Gli studi tossicologici in vitro vengono eseguiti per prevedere gli effetti tossici di sostanze chimiche e altri agenti che possono causare danni alle cellule. Nella valutazione della tossicità per la cornea, le cellule epiteliali corneali umane (HCEC) sono state utilizzate in modelli per valutare questi effetti 1,2,3,4. Questi modelli valutano tipicamente gli effetti fisiologici come i cambiamenti nell’attività metabolica della cellula, la proliferazione cellulare e altre funzioni cellulari come la produzione e il rilascio di citochine infiammatorie. Per questi studi tossicologici, sono state selezionate cellule provenienti da varie fonti per valutare gli effetti dannosi delle sostanze chimiche e delle radiazioni UV sugli HCEC ^2,3. Le linee pHCEC sono disponibili presso aziende che forniscono queste cellule da tessuti donatori di adulti. Le cellule primarie possono essere trattate con dispase e raschiate delicatamente dalla cornea per la coltura⁵. Le cellule vengono quindi testate per virus e contaminazione e quindi spedite crioconservate in dimetilsolfossido al 10%.

Il vantaggio delle linee cellulari primarie è che le cellule sono geneticamente identiche alle cellule del donatore. Questo è l’ideale, poiché un modello in vitro dovrebbe imitare il tessuto in vivo il più possibile. Lo svantaggio delle linee cellulari primarie è che hanno un numero limitato di divisioni o passaggi cellulari⁶. Il numero limitato di cellule disponibili limita il numero di esperimenti che possono essere condotti con una singola coltura primaria, aumentando il costo degli esperimenti.

Linee cellulari immortalizzate sono state utilizzate anche in modelli di tossicità per colture cellulari. Tuttavia, a differenza della linea cellulare primaria ottenuta da tessuto in vivo, la linea cellulare immortalizzata è stata geneticamente modificata. Le cellule immortalizzate sono create incorporando i geni di un virus nel DNA delle cellule primarie ^6,7,8. Le cellule con incorporazione genica virale di successo sono selezionate per la linea cellulare immortalata. Il vantaggio dell’immortalizzazione è che consente una rapida proliferazione indefinita, fornendo un numero illimitato di cellule per eseguire più esperimenti utilizzando la stessa linea cellulare. Ciò consente la coerenza tra gli esperimenti e riduce i costi.

Oltre ai cambiamenti nei geni che limitano la proliferazione cellulare, potrebbero verificarsi anche cambiamenti nell’espressione di geni di funzionalità critica⁹. Pertanto, lo svantaggio di utilizzare cellule immortalizzate è che potrebbero non rappresentare più le cellule originali in vivo in termini di risposta a vari stimoli esterni¹⁰. I confronti hanno comportato l’osservazione degli effetti tossici delle sostanze chimiche sui cheratociti corneali umani primari e immortalizzati¹¹, nonché sugli HCEC immortalizzati e sulle cellule primarie epiteliali corneali di coniglio¹². Il confronto tra gli effetti delle tossine sui cheratociti umani primari e sui cheratociti immortalizzati non ha mostrato differenze significative¹¹. Utilizzando i metodi descritti in questo articolo, verrà determinata l’efficacia di questi test per valutare la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine oculari su pHCEC e iHCEC.

Sono state selezionate tre tossine oculari comunemente utilizzate nei saggi in vitro: BAK,H 2 O₂ e SDS. Il BAK è un conservante cationico comunemente usato nelle soluzioni oftalmiche 13,14^, H 2O₂ è comunemente usato per disinfettare le lenti a contatto 15 e SDS è un tensioattivo anionico presente in detergenti e shampoo ¹⁴. Analogamente alle tossine oculari, le radiazioni UV possono anche causare danni significativi agli HCEC³. Inoltre, la sovraesposizione ai raggi UV può causare una condizione oculare nota come fotocheratite caratterizzata da sintomi di lacrimazione, sensibilità alla luce e sensazione di granulosità¹⁶.

C’è un numero illimitato di colture cellulari primarie che possono essere utilizzate e varie linee cellulari immortalizzate che sono state sviluppate. Pertanto, è stata intrapresa un’indagine per confrontare gli HCEC primari con una linea HCEC immortalata per determinare somiglianze e differenze tra i modelli che incorporano questi tipi di cellule.

Questa indagine ha utilizzato la microscopia per valutare le possibili differenze tra pHCEC e iHCEC sulla risposta fisiologica delle cellule ai raggi UV e alle tossine. Sono stati valutati anche gli effetti delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sull’attività metabolica cellulare e sul rilascio di citochine infiammatorie per le due linee cellulari. L’importanza di determinare le differenze tra le due linee cellulari è comprendere l’uso ottimale di queste linee cellulari per valutare: 1) l’effetto delle radiazioni UV sulle cellule, 2) gli effetti delle tossine sulle cellule e 3) i cambiamenti risultanti al metabolismo, alla vitalità cellulare e al rilascio di citochine cellulari per studi futuri.

Protocol

1. Coltura di pHCEC e iHCEC Coltivare i pHCEC e gli iHCEC nel mezzo epiteliale oculare umano (HOEM) con i seguenti integratori: 6 mM di L-glutammina, 0,002% di integratore di terreni cellulari O (Tabella dei materiali), 1,0 μM di epinefrina, 0,4% di integratore di terreni cellulari P (Tabella dei materiali), 5 μg/mL di insulina rh, 5 μg/mL di apo-transferrina e 100 ng/mL di idrocortisone emisuccinato in palloni rivestiti di collagene-1 (18 mL in un matraccio di coltura da 75…

Representative Results

Dimensioni della cellaGli HCEC primari e immortalati sono stati visualizzati con tre coloranti fluorescenti, che riflettono tre diversi stadi di vitalità cellulare. Le cellule vive sono verdi (calceina-AM), le cellule morte sono rosse (omodimero di etidio-1) e le cellule apoptotiche sono gialle (colore regolato dal computer V-annessina per una migliore visualizzazione del segnale di fluorescenza). Le cellule vive contengono esterasi nel citoplasma cellulare e convertono calcein-AM in calceina. Le ce…

Discussion

Sono state valutate le potenziali differenze nell’uso di due tipi di HCEC. Le cellule sono state collocate nello stesso mezzo (HOEM) a concentrazioni identiche di cellule e quindi esposte a brevi e lunghi periodi di radiazioni UV e tre tossine oculari. Le dosi di radiazioni UV e sostanze chimiche sono state selezionate in base ai loro effetti fisiologici, che erano abbastanza dannosi per le cellule da produrre risposte intermedie che potevano essere confrontate. I tempi di esposizione di 5 e 20 minuti per le radiazioni U…

Materials

75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036