Bestämning av toxiciteten hos UV-strålning och kemikalier på primära och odödliggjorda humana hornhinneepitelceller

Summary

Denna artikel beskriver de förfaranden som används för att utvärdera toxiciteten hos UV-strålning och kemiska toxiner på en primär och odödliggjord cellinje.

Abstract

Denna artikel beskriver metoderna för att mäta toxiciteten hos ultraviolett (UV) strålning och okulära toxiner på primära (pHCEC) och odödliggjorda (iHCEC) humana hornhinneepitelcellkulturer. Cellerna utsattes för UV-strålning och toxiska doser av bensalkoniumklorid (BAK), väteperoxid (_H2O2) och natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolisk aktivitet mättes med hjälp av en metabolisk analys. Frisättningen av inflammatoriska cytokiner mättes med användning av en multiplex interleukin (IL) -1β, IL-6, IL-8 och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) analys, och celler utvärderades för livskraft med användning av fluorescerande färgämnen.

De skadliga effekterna av UV på cellmetabolisk aktivitet och cytokinfrisättning inträffade vid 5 minuters UV-exponering för iHCEC och 20 min för pHCEC. Liknande procentuella minskningar av metabolisk aktivitet hos iHCEC och pHCEC inträffade efter exponering för BAK,_H2O2eller SDS, och de mest signifikanta förändringarna i cytokinfrisättning inträffade för IL-6 och IL-8. Mikroskopi av fluorescerande färgade iHCEC- och pHCEC BAK-exponerade celler visade celldöd vid 0,005% BAK-exponering, även om graden av etidiumfärgning var större i iHCECs än pHCEC. Genom att använda flera metoder för att bedöma toxiska effekter med hjälp av mikroskopi, bedömningar av metabolisk aktivitet och cytokinproduktion kunde toxiciteten hos UV-strålning och kemiska toxiner bestämmas för både primära och odödliga cellinjer.

Introduction

In vitro toxikologiska studier utförs för att förutsäga de toxiska effekterna av kemikalier och andra medel som kan orsaka skador på celler. Vid bedömning av toxicitet för hornhinnan har humana hornhinneepitelceller (HCEC) använts i modeller för utvärdering av dessa effekter 1,2,3,4. Dessa modeller utvärderar typiskt fysiologiska effekter såsom förändringar i cellens metaboliska aktivitet, cellproliferation och andra cellfunktioner såsom produktion och frisättning av inflammatoriska cytokiner. För dessa toxikologiska studier har celler från olika källor valts ut för att bedöma de skadliga effekterna av kemikalier och UV-strålning på HCECs ^2,3. pHCEC-linjer är tillgängliga från företag som tillhandahåller dessa celler från donatorvävnader hos vuxna. Primära celler kan behandlas med dispase och försiktigt skrapas av hornhinnan för odling⁵. Cellerna testas sedan för virus och kontaminering och skickas sedan kryokonserverade i 10% dimetylsulfoxid.

Fördelen med primära cellinjer är att cellerna är genetiskt identiska med donatorns celler. Detta är idealiskt, eftersom en in vitro-modell bör efterlikna in vivo-vävnaden så mycket som möjligt. Nackdelen med primära cellinjer är att de har ett begränsat antal celldelningar eller passager⁶. Det begränsade antalet tillgängliga celler begränsar antalet experiment som kan utföras med en enda primärkultur, vilket ökar kostnaden för experimenten.

Odödliga cellinjer har också använts i cellodlingstoxicitetsmodeller. Men till skillnad från den primära cellinjen erhållen från in vivo-vävnad har den odödliga cellinjen förändrats genetiskt. Odödliga celler skapas genom att införliva generna av ett virus i DNA av primära celler ^6,7,8. Celler med framgångsrik viral geninkorporering väljs ut för den odödliga cellinjen. Fördelen med odödliggörande är att det möjliggör obestämd snabb spridning, vilket ger ett obegränsat antal celler att utföra flera experiment med samma cellinje. Detta möjliggör konsekvens mellan experiment och minskar kostnaden.

Förutom förändringar i generna som begränsade cellproliferation kan förändringar i uttrycket av gener med kritisk funktionalitet också inträffa⁹. Därför är nackdelen med att använda odödliga celler att de kanske inte längre representerar de ursprungliga in vivo-cellerna när det gäller deras svar på olika yttre stimuli¹⁰. Jämförelser har involverat observation av de toxiska effekterna av kemikalier på primära och odödliga humana hornhinnekeratocyter¹¹, liksom odödliga HCECs och kaninhornhinnans epiteliala primära celler¹². Jämförelsen mellan effekterna av toxiner på primära humana keratocyter och odödliga keratocyter visade inga signifikanta skillnader¹¹. Med hjälp av de metoder som beskrivs i denna artikel kommer effektiviteten av dessa analyser för att bedöma toxiciteten hos UV-strålning och okulära toxiner på pHCECs och iHCECs att bestämmas.

Tre okulära toxiner som vanligen används i in vitro-analyser valdes: BAK,_H2O2och SDS. BAK är ett katjoniskt konserveringsmedel som vanligtvis används i oftalmiska lösningar 13,14^, _H2O2används vanligtvis för att desinficera kontaktlinser 15 och SDS är ett anjoniskt ytaktivt medel som finns i tvättmedel och schampon ¹⁴. I likhet med ögontoxiner kan UV-strålning också orsaka betydande skador på HCECs³. Dessutom kan överexponering för UV orsaka ett okulärt tillstånd som kallas fotokeratit som kännetecknas av symtom på rivning, ljuskänslighet och en känsla av grusighet¹⁶.

Det finns ett obegränsat antal primära cellkulturer som kan användas och olika odödliga cellinjer som har utvecklats. Därför genomfördes en undersökning för att jämföra primära HCECs med en odödlig HCEC-linje för att bestämma likheter och skillnader mellan modeller som innehåller dessa typer av celler.

Denna undersökning använde mikroskopi för att bedöma möjliga skillnader mellan pHCECs och iHCECs på cellfysiologiskt svar på UV och toxiner. Effekterna av UV-strålning och kemikalier på cellmetabolisk aktivitet och inflammatorisk cytokinfrisättning för de två cellinjerna utvärderades också. Vikten av att bestämma skillnaderna mellan de två cellinjerna är att förstå den optimala användningen av dessa cellinjer för att utvärdera: 1) effekten av UV-strålning på celler, 2) effekterna av toxiner på celler och 3) de resulterande förändringarna i metabolism, cellviabilitet och cellcytokinfrisättning för framtida studier.

Protocol

1. Odling av pHCEC och iHCEC Odla pHCECs och iHCECs i humant okulärt epitelmedium (HOEM) med följande tillskott: 6 mM L-glutamin, 0,002% cellmediatillskott O (Materialförteckning), 1,0 μM epinefrin, 0,4% cellmediatillskott P (Materialförteckning), 5 μg / ml rh insulin, 5 μg / ml apo-transferrin och 100 ng / ml hydrokortisonhemisuccinat i kollagen-1-belagda odlingskolvar (18 ml i en 75 cm2 kulturkolv). Byt medium i kolvarna var 2-3: e dag genom att ta…

Representative Results

CellstorlekDe primära och odödliga HCECs visualiserades med tre fluorescerande färgämnen, som återspeglar tre olika stadier av cellviabilitet. Levande celler är gröna (calcein-AM), döda celler är röda (etidium homodimer-1) och apoptotiska celler är gula (annexin V-datorjusterad färg för bättre visualisering av fluorescenssignalen). Levande celler innehåller esteraser i cellcytoplasman och omvandlar kalcein-AM till kalcein. Döda celler har cellmembran som är permeabla för etidiumhomo…

Discussion

Potentiella skillnader i användningen av två typer av HCECs bedömdes. Cellerna placerades i samma medium (HOEM) vid identiska koncentrationer av celler och utsattes sedan för korta och långa perioder av UV-strålning och tre okulära toxiner. Doser av UV-strålning och kemikalier valdes utifrån deras fysiologiska effekter, som var tillräckligt skadliga för cellerna för att producera mellanliggande svar som kunde jämföras. Exponeringstider på 5 och 20 min för UV-strålning och 5 och 15 minuter för de valda d…

Materials

75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036