Aqui relatamos um método de bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para biofabricagem de tecidos neurais para estudar a funcionalidade dos astrócitos no sistema nervoso central e os mecanismos que envolvem células gliais em doenças neurológicas e tratamentos.
Os astrócitos são células gliais com um papel essencial no sistema nervoso central (SNC), incluindo suporte neuronal e funcionalidade. Essas células também respondem a lesões neurais e agem para proteger o tecido de eventos degenerativos. Estudos in vitro da funcionalidade dos astrócitos são importantes para elucidar os mecanismos envolvidos nesses eventos e contribuir para o desenvolvimento de terapias para tratar distúrbios neurológicos. Este protocolo descreve um método para biofabricar uma estrutura de tecido neural rica em astrócitos por bioimizades 3D carregados de astrócitos. Uma bioimpressora 3D baseada em extrusão foi usada neste trabalho, e os astrócitos foram extraídos dos cortices cerebrais dos filhotes de C57Bl/6. O bioink foi preparado pela mistura de astrócitos cortical de até a passagem 3 para uma solução biomaterial composta de gelatina, gelatina-methacryloyl (GelMA) e fibrinogênio, complementado com laminina, que apresentava condições ótimas de bioimpressão. As condições de bioimpressão 3D minimizaram o estresse celular, contribuindo para a alta viabilidade dos astrócitos durante o processo, em que 74,08% ± 1,33% das células eram viáveis logo após a bioimpressão. Após 1 semana de incubação, a viabilidade dos astrócitos aumentou significativamente para 83,54% ± 3,00%, indicando que o construto 3D representa um microambiente adequado para o crescimento celular. A composição do biomatélmico permitiu o apego celular e estimulou o comportamento astrócito, com células expressando os astrócitos específicos marcador de proteína ácida fibrilar glicial (GFAP) e possuindo morfologia astróctica típica. Este protocolo reprodutível fornece um método valioso para biofabricar tecido neural 3D rico em astrócitos que se assemelha ao microambiente nativo das células, útil para pesquisadores que visam entender a funcionalidade dos astrócitos e sua relação com os mecanismos envolvidos em doenças neurológicas.
Os astrócitos são o tipo celular mais abundante no Sistema Nervoso Central (SNC) e desempenham um papel fundamental na homeostase cerebral. Além do suporte neuronal duradouro, os astrócitos são responsáveis por modular a absorção de neurotransmissores, manter a integridade da barreira hematoencefálica e regular a sinapstogênese neuronal1,2. Os astrócitos também têm um papel essencial na inflamação do SNC, respondendo a lesões no cérebro em um processo que leva à reatividade astrocativa ou astrogliose reativa3,4, formando uma cicatriz gliar que impede a exposição saudável do tecido aos agentes degenerativos5. Este evento resulta em mudanças na expressão genética dos astrócitos, morfologia e função6,7. Portanto, estudos envolvendo a funcionalidade dos astrócitos são úteis para o desenvolvimento de terapias para tratar distúrbios neurológicos.
Modelos in vitro são cruciais para estudar mecanismos relacionados a lesões neurológicas, e embora o isolamento bem sucedido e a cultura bidimensional (2D) dos astrócitos cortical tenham sido estabelecidos8,este modelo não fornece um ambiente realista que imita o comportamento celular nativo e para reproduzir a complexidade do cérebro9 . Em condição 2D, o fraco suporte mecânico e bioquímico, as interações de células baixas e matriz celular e o achatamento celular, levando à ausência de polaridade basal-apical, afetam a dinâmica de sinalização celular e os desfechos experimentais levando à alteração da morfologia celular e expressão genética, que comprometem a resposta aos tratamentos10. Por isso, é fundamental desenvolver alternativas que proporcionem um ambiente neural mais realista, visando traduzir os resultados para a clínica.
A cultura celular tridimensional (3D) representa um modelo mais avançado que recapitula com características de fidelidade aumentadas de órgãos e tecidos, incluindo o CNS11. Em relação à cultura gliana, os modelos 3D contribuem para a manutenção da morfologia dos astrócitos, polaridade basal-apical celular e sinalização celular12,13. A tecnologia de bioimpressão 3D surgiu como uma poderosa ferramenta para biofabritor tecidos vivos 3D de forma controlada, usando células e biomateriais para recriar a estrutura e propriedades dos tecidos nativos. O uso dessa tecnologia levou a uma melhoria substancial da previsão de resultados e contribuiu para a medicina regenerativa aplicada ao CNS14,15,16.
O protocolo descrito aqui detalha o isolamento e a cultura dos astrócitos cortical. O protocolo também detalha um método reprodutível para bioimpressão de astrócitos embutidos em gelatina/gelatina methacryloyl (GelMA)/fibrinogen, complementado com laminina. Neste trabalho, uma bioimpressora baseada em extrusão foi usada para imprimir a composição biomaterial contendo astrócitos cortical a uma densidade de 1 x106 células/mL. O estresse da tesoura de bioimpressão foi minimizado pelo controle da velocidade de impressão, e os astrócitos apresentaram alta viabilidade após o processo. Construções bioimpressadas foram cultivadas por 1 semana, e os astrócitos foram capazes de se espalhar, anexar e sobreviver dentro do hidrogel, mantendo a morfologia astróctica e expressando um marcador específico de proteína ácida fibrilar (GFAP)4.
Este procedimento é compatível com bioimpressoras baseadas em extrusão orientadas por pistão e pode ser usado para bioimpressão de astrócitos derivados de diferentes fontes. O modelo bioimpresso 3D proposto aqui é adequado para uma ampla gama de aplicações de engenharia neural, como estudos dos mecanismos envolvidos na funcionalidade de astrócitos em tecidos saudáveis e compreensão da progressão de patologias neurológicas e desenvolvimento do tratamento.
A tecnologia de bioimpressão 3D surgiu como uma alternativa de biofabricação que permite a engenharia de construtos refinados que se assemelham estrutural e fisiologicamente aos tecidos nativos22, incluindo o cérebro23. A biofabricação de tecidos neurais permite a modelagem in vitro de microambientes nativos, sendo uma importante ferramenta para a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares associados ao desenvolvimento e tratamento de muitas doenças…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), números de bolsas 2018/23039-3 e 2018/12605-8; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), números de bolsas 465656/2014-5 e 309679/2018-4; e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), código financeiro 001.
3D Bioprinter | 3D Biotechnology Solutions | Extrusion-based bioprinter | |
Blunt-tip forceps | Integra Miltex | 6–30 | Forceps for brain dissection previously sterilized |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Protease free, fatty acid free, essentially globulin free |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
Cell culture flask | Fisher Scientific | 156340 | Culture flask T25 |
Cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | Cell strainer 40 µm |
Confocal microscope | Leica | Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system | |
Conical tubes | Thermo Scientific | 339651, 339652 | Sterile tubes of 15 mL and 50 mL |
DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI staining solution |
DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
Dyalisis tubing | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14 kDa |
Ethanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reagent grade |
Fetal Bovine Serum | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Research Grade |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma |
Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Gelatin powder from porcine skin |
Glycine | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glycine powder |
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamine crystalline powder |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl |
Live dead kit cell imaging kit | Thermo Scientific | R37601 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | For GelMA preparation |
Microtubes | Corning Incorporated | MCT-150-C | Microtubes of 1,5 mL |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Needle 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Sterile blunt needle |
Operating scissor | Integra Miltex | 05–02 | Sharp scissor for brain dissection previously sterilized |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde powder |
Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin) |
Petri dish | Corning Incorporated | 430591, 430588 | Sterile petri dishes of 35 and 100 mm |
Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reagent |
Photoinitiator | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone |
Phosphate buffer saline (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
Spatula | Miltex | V973-70 | Number 24 cement spatula previously sterilized |
Stereomicroscope | Fisherbrand | 3000038 | Microscope for brain dissection |
Syringe 5 mL | BD | 1222C84 | Sterile syringe |
Syringe filter 2 µm | Fisher Scientific | 09-740-105 | Polypropylene filter for sterilization |
Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002–04-4 | Thrombin cristalline powder from bovine plasma |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratory grade |
Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS |
Versene solution | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS |
Well plate | Thermo Scientific | 144530 | Sterile 24-well plate |