该协议描述了两种敏感的检测方法,用于区分肌萎缩性侧索硬化症秀 丽隐杆线虫 模型中的轻度、中度和重度运动障碍,通常适用于运动改变的 秀丽隐杆线虫 菌株。
神经退行性疾病肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的特征是运动神经元的进行性丧失,伴有肌肉无力和运动障碍,随着时间的推移而恶化。虽然在确定一部分患者的ALS遗传驱动因素方面取得了相当大的进展,但大多数病例的病因尚不清楚。此外,运动神经元功能障碍和退化的潜在机制尚不清楚;因此,需要不断开发和表征代表性模型来研究这些过程。 秀丽隐杆线虫 可以使其运动适应周围环境的物理限制,在实验室环境中研究了两种主要的运动范式 – 在固体表面上爬行并在液体中游泳。这些代表了感觉,运动神经元和肌肉之间的复杂相互作用。ALS 的秀丽隐杆线虫 模型可以在这些运动范式中的一种或两种表现出损伤。该协议描述了两种用于评估 秀丽隐杆线虫运动性的灵敏测定:优化的径向运动测定法测量固体表面上的爬行情况,以及用于跟踪和分析液体游泳(暴击)的自动化方法。除了表征ALS模型的基线运动损伤外,这些测定还可以检测遗传或小分子干预对表型的抑制或增强。因此,这些方法对于研究ALS模型和任何表现出运动改变的 秀丽隐杆线虫 菌株具有实用性。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种使人衰弱的,与衰老相关的神经退行性疾病,对运动神经元有特别的影响。该病的特征是大脑和脊髓中的运动神经元丧失以及进行性运动障碍。这会导致严重的功能障碍和过早死亡,通常在诊断后 3-5 年内1。至少38个基因的突变可引起ALS;然而,大多数ALS患者在神经元和神经胶质细胞中积累了泛素化的TDP-43蛋白包涵体作为其主要病理学2,3,4。已经开发了许多动物模型来研究导致或促成 体内 ALS的潜在机制(在5中回顾)。 在 秀丽隐杆线虫中, 这些模型包括ALS致病基因同源物中的遗传功能丧失突变或人类ALS基因的转基因表达。在 秀丽隐杆线虫中对 ALS 进行建模有许多优点。 秀丽隐杆线虫 是一种易于处理的简单动物,具有分化的神经系统,具有良好的行为范式特征,并且与人类具有相当大的遗传同源性6,7。存在许多用于与 秀丽隐杆线虫合作的工具,包括强大的基因组编辑能力,神经变性的 体内 荧光报告基因,RNAi筛选范式,可处理的遗传学以及已建立的行为和表型测定。ALS的 秀丽隐杆线虫 模型概括了人类疾病的各个方面,包括不溶性蛋白的积累,神经变性和早逝8,9。此外,许多 秀丽隐杆线虫 ALS 模型中都存在以爬行和游泳行为障碍为特征的运动功能障碍。
该协议描述了表征 秀丽隐杆线虫 运动表型的两种方法:用于评估固体表面爬行的径向运动测定和使用WormLab自动跟踪和分析评估液体游泳(暴击)。这些表征运动缺陷的灵敏方法允许比较严重程度,并为测量运动表型的抑制和增强提供了工具。径向运动测定可量化蠕虫种群之间爬行运动(固体表面上的正弦运动)的差异。该测定利用 秀丽隐杆线虫 的自然未受刺激的探索行为,将蠕虫放置在板上的单个位置,并在给定的时间段后标记其最终位置10。或者,在液体中游泳(打捻)测定在设定的时间段内计算单个蠕虫的身体弯曲。人眼对身体弯曲的手动计数是耗时的,并且通常在实验者之间表现出相当大的差异。使用计算机辅助的自动跟踪和分析可以消除大部分这种可变性。除了表征ALS模型的基线运动损伤外,径向运动和游泳测定都可以从遗传或小分子干预中检测出不同运动表型的调节。这些方法对于研究ALS模型和任何表现出运动改变的 秀丽隐杆线虫 菌株具有实用性。
径向运动:
通过更改时间变量可以轻松控制该测定的分辨率。增加时间长度可以更容易地观察具有严重表型的动物之间的差异,从而识别细微的差异。然而,由于该测定法测量位移,如果测定时间延长过长,具有正常运动性的动物(例如N2)将移动到板的边缘,并且觅食行为将导致回溯。这将人为地减少对行进距离的测量。时间过长可能导致菌株之间的差异消失,特别是在运动表型不太严重的动物之间,因为动物均匀地分散在板上。缩短时间变量将防止更活跃的蠕虫找到板的边缘。此方法不跟踪每个蠕虫行进的总距离,而是将每个蠕虫的行进距离压缩为距板中心的线性距离。因此,它本质上不如记录单个蠕虫总轨道长度的方法可靠。然而,径向运动测定只需要很少的研究人员培训,使用大多数蠕虫实验室中常见的相对经济实惠的试剂,并且足够灵敏,可以产生显着且可重复的结果。对于更喜欢自动视频跟踪的实验室,之前已经建立了几种方法来跟踪和分析爬行运动12,或者可以更改本文中用于游泳测定的软件参数,以允许爬行检测和分析。
该实验通常一式三份的独立重复进行,每次复制一组30-40个蠕虫。每个复制被分成两个不同的100 mm或150 mm板,每个板有15-20个蠕虫。使用比建议的更多的蠕虫可能会使它难以有效地得分。总得分为 90+ 的人数足以确定轻度、中度或重度运动障碍的重要性。与评分菌株之间的时间一致对于准确性和可重复性至关重要。30分钟通常足够长,以建立中度至重度表型之间的差异,例如表达人类突变TDP-43的转基因菌株与野生型蠕虫相比(图4)。如果时间变量将延长,建议将板的尺寸从100 mm增加到150 mm。温度和湿度等环境因素会影响该测定,该测定通常在环境室温下进行,因此在比较重复时始终使用野生型(N2)对照很重要。此外,该测定可以测量一些在液体中不表现出正常游泳行为(暴击)的菌株的运动性,使其成为游泳测定的有用补充。
游泳检测:
使用成像和采集系统自动跟踪和分析蠕虫游泳,可以获得严格和无偏倚的数据。但是,在实验的初始设置过程中,需要在样品之间控制几个因素。这些包括开始记录之前适应液体的时间,环境条件(即温度,湿度)以及一致的光线和记录设置。在录制阶段,有几个功能有助于减少板之间的可变性。其中包括集成的轨道安装式摄像机和明场载物台,使录制视频在板之间保持一致,载物台周围的屏蔽可防止录制时的反射,眩光和空气流动,以及强大的软件包,可可靠地检测蠕虫并允许在视频后期处理中手动校正轨迹。在该协议中,将带有蠕虫的35 mm板的视频录制1分钟,然后使用软件包进行处理。处理后,手动校正跟踪可确保准确记录蠕虫行为,而不会混淆跟踪错误。转弯计数和跟踪持续时间数据用于确定每分钟转弯数作为最终读数。为了确保可重复性,在至少3个独立的重复实验中收集数据,每个实验对40-50只动物进行评分,以实现120-150只动物的总和最终数量。这个数字足以区分游泳行为与对照蠕虫的微小差异。一些蠕虫的运动缺陷太严重,无法通过游泳测定捕获。例如,如果将动物置于液体介质卷曲而不是执行预期的暴动反应,则该测定将不能准确记录这些运动,并且另一种运动测定,例如径向运动,可以更好地捕获这些运动缺陷。所提供的协议使用市售的成像系统(有关详细信息,请参阅 材料表 ),但其他蠕虫跟踪系统可能提供类似的实用程序,其中一些是开源的12。以前发布的方法描述了蠕虫暴击的手动评分13。虽然自动分析为每个单独的蠕虫生成了许多指标,但以每分钟撞击次数为单位测量的身体弯曲检测在实验之间提供了一致的结果,并且通过眼睛对蠕虫撞击的传统评分可以很好地跟踪。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢审稿人的有益意见和建议。我们感谢Aleen Saxton,Brandon Henderson和Jade Stair出色的技术援助。我们感谢Brian Kraemer和Rebecca Kow协助开发这些检测方法。这些材料是VA普吉特海湾医疗保健系统的资源支持和设施使用的结果。这项工作得到了美国(U.S.)的资助。退伍军人事务部(VA)生物医学实验室研究与发展服务[向N.F.L.颁发的功绩审查#I01BX004044]
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |