यह प्रोटोकॉल एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस के सी एलिगन्स मॉडल में हल्के, मध्यम और गंभीर मोटर हानि के बीच भेदभाव के लिए दो संवेदनशील assays का वर्णन करता है, जिसमें C. elegans उपभेदों के लिए सामान्य उपयोगिता के साथ, परिवर्तित गतिशीलता के साथ।
न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) में मांसपेशियों की कमजोरी और मोटर हानि के साथ मोटर न्यूरॉन्स का प्रगतिशील नुकसान होता है जो समय के साथ खराब हो जाता है। जबकि रोगियों के सबसेट के लिए एएलएस के आनुवंशिक ड्राइवरों को निर्धारित करने में काफी प्रगति हुई है, अधिकांश मामलों में एक अज्ञात एटियलजि है। इसके अलावा, मोटर न्यूरॉन शिथिलता और अध: पतन अंतर्निहित तंत्र अच्छी तरह से समझ में नहीं आते हैं; इसलिए, इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रतिनिधि मॉडल को विकसित करने और चिह्नित करने की एक निरंतर आवश्यकता है। Caenorhabditis elegans अपने आंदोलन को अपने परिवेश की भौतिक बाधाओं के लिए अनुकूलित कर सकते हैं, जिसमें दो प्राथमिक आंदोलन प्रतिमानों का अध्ययन प्रयोगशाला वातावरण में किया जाता है- एक ठोस सतह पर रेंगना और तरल में तैरना। ये सनसनी, मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के बीच एक जटिल इंटरप्ले का प्रतिनिधित्व करते हैं। एएलएस के सी एलिगन्स मॉडल इन आंदोलन प्रतिमानों में से एक या दोनों में हानि प्रदर्शित कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल C. elegans में गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए दो संवेदनशील assays का वर्णन करता है: एक अनुकूलित रेडियल लोकोमोशन परख एक ठोस सतह पर रेंगने को मापने और ट्रैकिंग और तरल (थ्रैशिंग) में तैराकी का विश्लेषण करने के लिए एक स्वचालित विधि। एएलएस मॉडल के बेसलाइन मोटर हानि के लक्षण वर्णन के अलावा, ये assays आनुवंशिक या छोटे अणु हस्तक्षेपों से फेनोटाइप के दमन या वृद्धि का पता लगा सकते हैं। इस प्रकार, इन विधियों में एएलएस मॉडल और किसी भी सी एलिगन्स स्ट्रेन का अध्ययन करने के लिए उपयोगिता है जो परिवर्तित गतिशीलता प्रदर्शित करता है।
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) मोटर न्यूरॉन्स पर एक विशेष प्रभाव के साथ एक दुर्बल, उम्र बढ़ने से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है। इस रोग में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स की हानि और प्रगतिशील मोटर हानि होती है। इसके परिणामस्वरूप प्रमुख कार्यात्मक विकलांगता और समय से पहले मृत्यु हो जाती है, आमतौर पर निदान के बाद 3-5 वर्षों के भीतर। कम से कम 38 जीनों में उत्परिवर्तन एएलएस का कारण बन सकता है; हालांकि, एएलएस के साथ अधिकांश रोगियों को न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं 2,3,4 में उनकी प्राथमिक विकृति के रूप में प्रोटीन टीडीपी –43 के ubiquitinated inclusions जमा करते हैं। विवो में एएलएस के कारण या योगदान देने वाले अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए कई पशु मॉडल विकसित किए गए हैं (5 में समीक्षा की गई)। C. elegans में, इन मॉडलों में ALS-कारण जीन या मानव ALS जीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के होमोलॉग्स में आनुवंशिक हानि-के-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन शामिल हैं। C. elegans में ALS मॉडलिंग के कई फायदे हैं। C. elegans एक विभेदित तंत्रिका तंत्र, अच्छी तरह से विशेषता वाले व्यवहार प्रतिमानों, और मनुष्यों के लिए काफी आनुवंशिक होमोलॉजी के साथ एक सभ्य सरल जानवर हैं6,7। सी elegans के साथ काम करने के लिए कई उपकरण मौजूद हैं, जिसमें मजबूत जीनोम संपादन क्षमताएं शामिल हैं, न्यूरोडीजेनेरेशन के विवो फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों में, आरएनएआई स्क्रीनिंग प्रतिमान, असभ्य आनुवांशिकी, और स्थापित व्यवहार और फेनोटाइपिक assays। एएलएस के एलिगन्स मॉडल मानव रोग के पहलुओं को दोहराते हैं, जिसमें अघुलनशील प्रोटीन, न्यूरोडीजेनेरेशन और शुरुआती मृत्यु 8,9 का संचय शामिल है। इसके अलावा, रेंगने और तैराकी दोनों व्यवहारों की गड़बड़ी की विशेषता वाली मोटर शिथिलता कई सी एलिगेंस एएलएस मॉडल में मौजूद है।
यह प्रोटोकॉल C. elegans मोटर फेनोटाइप्स को चिह्नित करने के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है: एक ठोस सतह पर रेंगने का मूल्यांकन करने के लिए रेडियल लोकोमोशन परख और वर्मलैब स्वचालित ट्रैकिंग और विश्लेषण का उपयोग करके तरल (थ्रैशिंग) में तैराकी का आकलन। मोटर घाटे की विशेषता के लिए ये संवेदनशील तरीके गंभीरता की तुलना की अनुमति देते हैं और मोटर फेनोटाइप के दमन और संवर्द्धन को मापने के लिए उपकरण प्रदान करते हैं। रेडियल लोकोमोशन परख रेंगने गतिशीलता (एक ठोस सतह पर sinusoidal आंदोलन) कीड़े की आबादी के बीच में अंतर की मात्रा. इस परख सी elegans प्राकृतिक unstimulated अन्वेषण व्यवहार का लाभ उठाता है एक प्लेट पर एक ही स्थान में कीड़े रखने और time10 की एक दी गई अवधि के बाद अपने अंतिम स्थान को चिह्नित करके. वैकल्पिक रूप से, तरल (थ्रैशिंग) assays assays में तैराकी समय की एक निर्धारित अवधि में व्यक्तिगत कीड़े के शरीर के मोड़ की गिनती. मानव आंख द्वारा शरीर के झुकने की मैनुअल गिनती समय-गहन है और आमतौर पर प्रयोगकर्ताओं के बीच काफी परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करती है। कंप्यूटर-सहायता प्राप्त स्वचालित ट्रैकिंग और विश्लेषण का उपयोग उस परिवर्तनशीलता को समाप्त कर सकता है। एएलएस मॉडल के बेसलाइन मोटर हानि के लक्षण वर्णन के अलावा, रेडियल लोकोमोशन और तैराकी एसेस दोनों आनुवंशिक या छोटे अणु हस्तक्षेपों से अलग-अलग लोकोमोटर फेनोटाइप के मॉडुलन का पता लगा सकते हैं। इन विधियों में एएलएस मॉडल और किसी भी सी एलिगेंस स्ट्रेन का अध्ययन करने के लिए उपयोगिता है जो परिवर्तित गतिशीलता प्रदर्शित करता है।
रेडियल लोकोमोशन:
इस परख के संकल्प आसानी से समय चर बदलने से नियंत्रित किया जाता है. समय की लंबाई बढ़ाने से गंभीर फेनोटाइप वाले जानवरों के बीच अंतर का निरीक्षण करना आसान हो जाता है, जिससे सूक्ष्म अंतर की पहचान होती है। हालांकि, क्योंकि यह परख विस्थापन को मापता है, अगर परख समय बहुत लंबे समय तक बढ़ाया जाता है, तो सामान्य गतिशीलता वाले जानवर, जैसे कि एन 2, प्लेट के किनारों की यात्रा करेंगे, और फोर्जिंग व्यवहार बैकट्रैकिंग का कारण बनेगा। यह कृत्रिम रूप से यात्रा की गई दूरी के माप को कम कर देगा। समय अवधि जो बहुत लंबी होती है, उपभेदों के बीच मतभेदों के गायब होने के परिणामस्वरूप हो सकती है, विशेष रूप से कम गंभीर मोटर फेनोटाइप वाले जानवरों के बीच, क्योंकि जानवर प्लेट में समान रूप से बिखरे हुए हो जाते हैं। समय चर को छोटा करने से प्लेट के किनारों को खोजने से अधिक सक्रिय कीड़े को रोका जा सकेगा। यह विधि प्रत्येक कीड़े के लिए यात्रा की गई कुल दूरी को ट्रैक नहीं करती है, लेकिन प्लेट के केंद्र से रैखिक दूरी में प्रत्येक कीड़े के लिए यात्रा की गई दूरी को संकुचित करती है। इस प्रकार, यह स्वाभाविक रूप से एक विधि की तुलना में कम मजबूत है जो व्यक्तिगत कीड़े की कुल ट्रैक लंबाई को रिकॉर्ड करता है। हालांकि, रेडियल लोकोमोशन परख के लिए बहुत कम शोधकर्ता प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, अपेक्षाकृत सस्ती अभिकर्मकों का उपयोग करता है जो आमतौर पर अधिकांश कृमि प्रयोगशालाओं में उपलब्ध होते हैं, और महत्वपूर्ण और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणामों का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील होते हैं। स्वचालित वीडियो ट्रैकिंग पसंद करने वाली प्रयोगशालाओं के लिए, क्रॉलिंग आंदोलनों को ट्रैक करने और विश्लेषण करने के लिए पहले कई तरीकों की स्थापना की गई है12, या इस पेपर में तैराकी परख के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर पैरामीटर को क्रॉलिंग डिटेक्शन और विश्लेषण की अनुमति देने के लिए बदला जा सकता है।
यह प्रयोग आमतौर पर प्रतिलिपि स्वतंत्र प्रतिकृतियों में किया जाता है, जिसमें प्रतिकृति प्रति 30-40 कीड़े का एक सेट होता है। प्रत्येक प्रतिकृति को दो अलग-अलग 100 मिमी या 150 मिमी प्लेटों पर विभाजित किया जाता है, जिसमें प्रति प्लेट 15-20 कीड़े होते हैं। प्रति प्लेट अनुशंसित से अधिक कीड़े का उपयोग करना कुशलतापूर्वक स्कोर करना मुश्किल बना सकता है। 90+ की कुल संख्या हल्के, मध्यम या गंभीर गतिशीलता हानि के लिए महत्व स्थापित करने के लिए पर्याप्त रूप से संचालित है। स्कोर किए गए उपभेदों के बीच समय के अनुरूप होने के नाते सटीकता और पुनरुत्पादन के लिए आवश्यक है। 30 मिनट आम तौर पर जंगली प्रकार के कीड़े (चित्रा 4) की तुलना में मानव उत्परिवर्ती टीडीपी -43 को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक उपभेदों जैसे मध्यम से गंभीर फेनोटाइप के बीच अंतर स्थापित करने के लिए काफी लंबा होता है। यदि समय चर को बढ़ाया जाएगा, तो प्लेट के आकार को 100 मिमी से 150 मिमी तक बढ़ाने की भी सलाह दी जाती है। तापमान और आर्द्रता जैसे पर्यावरणीय कारक इस परख को प्रभावित कर सकते हैं, जो आमतौर पर परिवेश के कमरे के तापमान पर आयोजित किया जाता है, इसलिए प्रतिकृतियों की तुलना करते समय हमेशा एक जंगली-प्रकार (एन 2) नियंत्रण का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इस परख कुछ उपभेदों है कि तरल (thrashing) में सामान्य तैराकी व्यवहार प्रदर्शित नहीं करते हैं की गतिशीलता को मापने कर सकते हैं, यह तैराकी परख के लिए एक उपयोगी पूरक बनाने.
तैराकी परख:
इमेजिंग और अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग ट्रैकिंग और वर्म तैराकी के विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए कठोर और निष्पक्ष डेटा के लिए अनुमति देता है। हालांकि, प्रयोग के प्रारंभिक सेटअप के दौरान कई कारक हैं जिन्हें नमूनों के बीच नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है। इनमें रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले तरल के अनुकूल होने का समय, परिवेश की स्थिति (यानी, तापमान, आर्द्रता), और लगातार प्रकाश और रिकॉर्डिंग सेटिंग्स शामिल हैं। रिकॉर्डिंग चरण पर, कई विशेषताएं हैं जो प्लेटों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद करती हैं। इनमें एक एकीकृत ट्रैक-माउंटेड कैमरा और ब्राइट-फील्ड स्टेज शामिल है जो प्लेटों के बीच रिकॉर्डिंग वीडियो को सुसंगत बनाता है, मंच के चारों ओर परिरक्षण करता है जो रिकॉर्डिंग के दौरान प्रतिबिंब, चकाचौंध और हवा के आंदोलनों को रोकता है, और एक मजबूत सॉफ़्टवेयर पैकेज जो मज़बूती से कीड़े का पता लगाता है और वीडियो पोस्ट-प्रोसेसिंग में पटरियों के मैनुअल सुधार की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, कीड़े के साथ 35 मिमी प्लेट के वीडियो को 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड किया जाता है और फिर सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके संसाधित किया जाता है। प्रसंस्करण के बाद, पटरियों का मैनुअल सुधार यह सुनिश्चित करता है कि वर्म व्यवहार ट्रैकिंग त्रुटियों को भ्रमित किए बिना सटीक रूप से दर्ज किए जाते हैं। टर्न काउंट और ट्रैक अवधि डेटा का उपयोग अंतिम रीडआउट के रूप में प्रति मिनट टर्न निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए, डेटा को कम से कम 3 स्वतंत्र प्रतिकृति प्रयोगों पर एकत्र किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक में 40-50 जानवरों ने स्कोर किया, ताकि 120-150 जानवरों की संयुक्त अंतिम संख्या प्राप्त की जा सके। यह संख्या नियंत्रण कीड़े से तैराकी व्यवहार में छोटे अंतर को भेदभाव करने के लिए पर्याप्त है। कुछ कीड़े मोटर घाटे भी तैराकी assays द्वारा कब्जा कर लिया जा करने के लिए गंभीर है. उदाहरण के लिए, यदि जानवरों को अपेक्षित पिटाई प्रतिक्रिया करने के बजाय एक तरल माध्यम कर्ल में रखा गया है, तो यह परख उन आंदोलनों को सटीक रूप से रिकॉर्ड नहीं करेगा और रेडियल लोकोमोशन जैसे एक और आंदोलन परख, उन गतिशीलता दोषों को बेहतर ढंग से कैप्चर कर सकते हैं। प्रदान किया गया प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करता है (अधिक विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें), लेकिन अन्य वर्म ट्रैकिंग सिस्टम एक समान उपयोगिता प्रदान कर सकते हैं, जिसमें कुछ खुले स्रोत 12 हैं। पहले प्रकाशित तरीके कीड़े thrashing13 के मैनुअल स्कोरिंग का वर्णन करते हैं। जबकि स्वचालित विश्लेषण प्रत्येक व्यक्तिगत कीड़े के लिए कई मीट्रिक का उत्पादन करता है, शरीर के मोड़ का पता लगाना जो प्रति मिनट थ्रैश में मापा जाता है, प्रयोगों के बीच सुसंगत परिणाम प्रदान करता है और आंखों द्वारा कीड़े की पिटाई के पारंपरिक स्कोरिंग के साथ अच्छी तरह से ट्रैक करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम उपयोगी टिप्पणियों और सुझावों के लिए समीक्षकों को धन्यवाद देते हैं। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एलीन सैक्सटन, ब्रैंडन हेंडरसन और जेड सीढ़ी को धन्यवाद देते हैं। हम ब्रायन क्रेमर और रेबेका कोउ को इन assays को विकसित करने में सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। यह सामग्री संसाधनों के साथ समर्थित काम और VA Puget ध्वनि स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली में सुविधाओं के उपयोग का परिणाम है। इस काम को संयुक्त राज्य अमेरिका (यू.एस.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था दिग्गजों के मामलों के विभाग (वीए) जैव चिकित्सा प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास सेवा [मेरिट समीक्षा अनुदान #I01BX004044 N.F.L.]
C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |