Utvärdering av motorisk försämring i C. elegans Modeller av amyotrofisk lateral skleros

Summary

Detta protokoll beskriver två känsliga analyser för diskriminering bland mild, måttlig och allvarliga motor nedskrivningar i C. elegans modeller av amyotrofisk lateral skleros, med allmän nytta för C. elegans stammar, med förändrad motility.

Abstract

Den neurodegenerativa sjukdomen amyotrofisk lateral skleros (ALS) har progressiv förlust av motoriska nervceller åtföljd av muskel svaghet och motorisk nedskrivningar som förvärras med tiden. Medan betydande framsteg har gjorts för att fastställa genetiska drivkrafter för ALS för en delmängd av patienter, har de flesta fall en okänd etiologi. Vidare är mekanismerna bakom motorisk neuron dysfunktion och degeneration inte väl förstådda; Därför finns det ett ständigt behov av att utveckla och karakterisera representativa modeller för att studera dessa processer. Caenorhabditis elegans kan anpassa sin rörelse till de fysiska begränsningarna i sin omgivning, med två primära rörelseparadigm studerade i laboratoriemiljö- krypande på en fast yta och simma i vätska. Dessa representerar ett komplext samspel mellan sensation, motoriska nervceller och muskler. C. elegans modeller av ALS kan uppvisa nedskrivningar i en eller båda av dessa rörelseparadigm. Detta protokoll beskriver två känsliga analyser för att utvärdera motilitet i C. elegans: en optimerad radiell rörelseanalys som mäter krypning på en fast yta och en automatiserad metod för att spåra och analysera simning i vätska (thrashing). Förutom karakteriseringen av baslinjemotorisk försämring av ALS-modeller, kan dessa analyser upptäcka undertryckande eller förbättring av fenotyper från genetiska eller små molekylinterventioner. Således har dessa metoder nytta för att studera ALS-modeller och alla C. elegans-stammar som uppvisar förändrad motilitet.

Introduction

Amyotrofisk lateral skleros (ALS) är en försvagande, åldrande-relaterade neurodegenerativa sjukdom med en särskild inverkan på motoriska nervceller. Sjukdomen har förlust av motoriska nervceller i hjärnan och ryggmärgen och progressiv motorisk försämring. Detta resulterar i större funktionella funktionshinder och för tidig död, vanligtvis inom 3-5 år efter ^diagnos1. Mutationer i minst 38 gener kan orsaka ALS; De flesta patienter med ALS ackumulerar dock allestädes närvarande införanden av proteinet TDP-43 som deras primära patologi i nervceller och gliaceller2,3,4. Ett antal djurmodeller har utvecklats för att studera de underliggande mekanismer som orsakar eller bidrar till ALS in vivo (granskas i ^fem). I C. elegans inkluderar dessa modeller genetiska förlust-av-funktion mutationer i homloggs av ALS-orsakande gener eller transgena uttryck av mänskliga ALS gener. Det finns många fördelar med att modellera ALS i C. elegans. C. elegans är ett dragbart enkelt djur med ett differentierat nervsystem, väl karakteriserade beteendeparadigm och betydande genetisk homologi för ^{människor6,7}. Många verktyg finns för att arbeta med C. elegans, inklusive robusta genomredigeringsfunktioner, in vivo fluorescerande reportrar av neurodegeneration, RNAi screening paradigms, dragbar genetik och etablerade beteendemässiga och fenotypiska analyser. C. elegans modeller av ALS rekapitulerar aspekter av mänskliga sjukdomar, inklusive ackumulering av olösligt protein, neurodegeneration och tidig ^död8,9. Vidare finns motorisk dysfunktion med störningar av både krypning och simning beteenden i många C. elegans ALS modeller.

Detta protokoll beskriver två metoder för att karakterisera C. elegans motor fenotyper: radiell rörelse assay för att utvärdera krypning på en fast yta och bedömningen av simning i vätska (thrashing) med hjälp av WormLab automatiserad spårning och analys. Dessa känsliga metoder för att karakterisera motoriska underskott tillåter jämförelser av svårighetsgrad och erbjuder verktyg för att mäta undertryckande och förbättringar av motor fenotyper. Den radiella rörelseanalysen kvantifierar skillnader i krypande motilitet (sinusformad rörelse på en fast yta) bland populationer av maskar. Denna analys drar nytta av C. elegans naturligt ostimulerat utforskningsbeteende genom att placera maskar på en enda plats på en tallrik och markera deras slutliga plats efter en viss ^tidsperiod10. Alternativt, simma i vätska (thrashing) analyser räkna kroppsböjningar av enskilda maskar under en viss tidsperiod. Den manuella räkningen av kroppsböjningar av det mänskliga ögat är tidsintensiv och uppvisar vanligtvis betydande variationer mellan experimenterare. Användningen av datorstödd automatiserad spårning och analys kan eliminera mycket av denna variabilitet. Förutom karakteriseringen av baslinjen motor nedskrivningar av ALS modeller, både radiell rörelse och simning analyser kan upptäcka modulering av distinkta locomotor fenotyper från genetiska eller små molekyl interventioner. Dessa metoder har nytta för att studera ALS-modeller och alla C. elegans-stammar som uppvisar förändrad motilitet.

Protocol

1. Radiell rörelseanalys Förbered petriskålar med 100 mm eller 150 mm diameter som är ungefär halvfulla med nematodtillväxtmedier (NGM) och sådda med en enhetlig gräsmatta av OP50-bakterier för att täcka hela agarens yta. Vänd NGM-analysplattorna upp och ner och märk botten med en identifierare för de C. elegans-stammar som ska analyseras, 2 plattor per stam (figur 1A). Gör en liten punkt med markören i mitten av den uppochnedvända plattan (bild 1A). När du arbetar med ett dissekerande mikroskop överför du 15-20 iscensatta matchade11 maskar till mitten av analysplattan direkt över mittpunkten (synlig genom NGM) med hjälp av en platinatrådsplockning (bild 1B).OBS: Försök att överföra alla maskar samtidigt eller så snabbt som möjligt. Ställ in en timer i 30 minuter efter att maskar har placerats i mitten av plattan. Sätt tillbaka locket på plattan och lägg det åt sidan (bild 1C). Fortsätt att överföra maskar tills alla stammar är på de utsedda analysplattorna, notera ungefär hur lång tid det tar att överföra mellan plattor (sikta på ~ 1 min mellan plattor). Förvara alla plåtar i samma ordning som de sattes upp. Efter 30 min, börja göra mål på första plattan. Ta bort locket och placera plattan med framsidan nedåt under dissekeringsmikroskopet, så att den märkta baksidan av plattan är vänd uppåt och NGM-agarn är mellan siktlinjen och maskarna. Plattan kommer att vara upp och ner från normal användning. Justera mikroskopfokuset tills maskar är synliga genom agaren. Använd en annan färgad filtspetspenna från mittpunkten, sätt en liten punkt på platsen för varje mask – följ maskspåren genom bakteriegräsmattan för att hitta de mest distala djuren. Kontrollera kanten på plattan eftersom vissa maskar kan hamna där. Räkna också och registrera antalet maskar i mittpunktspunkten (bild 1D). Fortsätt att markera alla analysplattor i ordning, så att alla plattor har 30 minuters aktivitetstid, var noga med att ta hänsyn till den tid det tog att ställa in plattan. Utför sedan manuella eller digitala mätningar enligt beskrivningen i steg 1.8 eller 1.9. Utför manuella mätningar med hjälp av en linjal. Använd en linjal för att mäta i mm, avståndet från mittpunkten till de slutliga platsmarkeringarna för varje mask och registrera avståndet. Om du vill hålla reda på förloppet under poängsättningen märker du den första poängpoängen med en liten markeringslinje. Registrera längddata för varje punkt i följd genom att rotera plattan medurs (bild 1E). Utför digital mätning med hjälp av en skanner och ImageJ. Med hjälp av en flatbäddsskanner skannar du baksidan av analysplattan(erna) bredvid en linjal (siffror som vetter mot skanningsytan) (bild 2A). Öppna den skannade plåtbilden i ImageJ eller ett liknande program.OBS: ImageJ är en gratis Java-baserad bildbehandlingsprogramvara som är värd för NIH. Klicka på verktyget med rak linje och rita sedan en linje som förbinder punkterna 1 cm och 2 cm på linjalens skannade bild (bild 2B).OBS: Om du håller i skiftdatorknappen tvingas linjen i närmaste 45°-vinkel. Navigera till Menyn Analysera och använd den för att ange skalan (Analysera | Ange skala) (bild 2C). Ange det kända avståndet (10) och längdenheter (mm) i lämpliga rutor, justera inte avståndet i bildpunktertal. Kontrollera Global om du vill använda samma skala på alla bilder som analyseras i varje ImageJ-session. Annars ställer du in skalan för varje bild när den öppnas (bild 2D). Klicka på Ok.OBS: Steg 1.9.2-1.9.5 utförs för att ställa in mätskalan. Mått för den här bilden relaterar nu automatiskt längden på linjerna till den definierade pixel: längdrelationen. Bilder som skannas med 300 dpi har en ungefärlig relation på 11,8 pixlar per mm. Använd penselverktyget för att markera strax ovanför den första punkten som ska poängsättas.OBS: Detta är en visuell indikator för den första masken som poängsatts. Använd verktyget Linjärt för att rita en linje från mittpunkten till den första maskdatapunkten. Klicka på M-tangenten på tangentbordet för att mäta avståndet. Du kan också navigera till menyn Analysera och välja Mått (Analysera | Mått). I båda fallen visas mätningen i ett nytt fönster. det här fönstret samlar in alla mått per bild. Håll mittpunkten konstant, flytta änden av linjen och vidrör den första maskpunkten till nästa maskpunkt, flytta medurs och klicka på M-tangenten för att mäta. Fortsätt mäta varje punkt medurs tills alla poäng har tagits. Kopiera och klistra in längdmätningsdata i ett kalkylblad för att spara dem. Upprepa sedan processen för varje skannad plåtbild.OBS: Steg 1.9.6 – 1.9.11 mäter maskförskjutningsvärdena (figur 2E-F). Utför statistisk analys. Kombinera replikat inom ett enda experiment så att det totala antalet poäng är mellan 30-40 maskar. Utför oberoende experimentella replikat på olika dagar och med oberoende populationer av maskar för att sluta med 3 oberoende experimentella replikat. Analysera data med hjälp av lämpliga statistiska analyser som Students t-test för 2 stammar eller 1-vägs ANOVA för tre eller flera stammar. 2. Datoranalyserad simanalys Obs: Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner för det kommersiellt tillgängliga WormLab-maskin- och programvarusystemet (se Tabell över material). Arbetsflödet kan dock tillämpas på andra datoranalyserade simanalyssystem. Konfigurera och spela in videor. Höj skärmningen på bildmaskinvaran (bild 3) och kontrollera att kamerahöjden är inställd på den förväntade platsen.OBS: Den optimala höjden för att fånga maskar på en 35 mm platta är sådan att den tredje från det bottengängade skruvhålet är synlig under det justerbara kameramonteringsfästet, men inget ytterligare monteringshål ses ovanför skruvhålet (cirka 30,5 cm över scenen) (figur 3C). Detta resulterar i ett infångstförhållande på 11,43 μm/pixel. Överväg att lägga till en indikator för “korrekt höjd” så att detta är lättare att bekräfta innan analysen påbörjas. Se protokollsteg 2.18 för att ta hänsyn till höjdjusteringar. Öppna tillhörande programvara (kompletterande figur 1A). Klicka på ikonen Video capture (film med en högerpekande triangel i mitten) för att öppna ett nytt videoinspelningsfönster . Kameran kommer att vara i livevisningen, men skärmen kommer att vara svart (kompletterande figur 1B). Tryck ner dimmervredet och vrid det medurs för att justera ljuset.OBS: Dimmervredet är på bildsystemets scen nära ljuskällan för det ljusa fältet. Livevisningen Video Capture förvandlas från svart till upplyst. Tillbaka i videoinspelningsfönstret klickar du på fliken Inställningar , justerar enligt följande: Videoläge: 2456 x 2052_Mono8, Bildhastighet: 14, Utgång: svartvit, Exponering: 0,00300 s, Förstärkning: 1 dB , Gamma: 1, Rotera 180 (kontrollera). Gå tillbaka till fliken Fånga . Välj inspelningsmappen (kompletterande bild 1B).OBS: Det är här alla inspelningar och projektfiler kommer att lagras. Skapa unika mappar för enskilda experiment för att hålla ordning på data. Tilldela ett filnamn genom att ange det i textrutan Arkivprefix .OBS: Programvaran kommer automatiskt att lägga till ett progressivt nummer i slutet av prefixet i formatet “0001”. Det är lämpligt att ha ett konsekvent namnschema för filerna som: “YYYYMMDD_treatmentName_rep#_”. Ange andra inspelningsinställningar enligt följande: Buffert: 128 bildrutor (standard), Varaktighet (kontrollera): 00 h:01min:00 s. Ignorera eller inaktivera andra inställningar på den här fliken. Placera analysplattan, locket uppåt, på enhetens scen och centrera den på videoinspelningsskärmen . ta bort locket.OBS: Förbered analysplattor i förväg. Varje tallrik består av en 35 mm Petriskål ungefär halvfull med osedd (ingen bakteriegräsmatta) NGM. Använd en mikropipette för att tvätta scenen synkroniserade11 maskar i 1 ml M9 på analysplattan – sikta på cirka 50 maskar (figur 3D). Virvla försiktigt plattan för att föra djuren till mitten eller använd en mikropipette för att tillsätta några droppar M9 för att separera djur (figur 3E). Ställ in en timer på 60 s så att maskar kan acklimatisera sig till simning.OBS: Plattan kommer inte att vara 100% synlig på skärmen. Djur spåras inte exakt vid överlappning. Medan timern räknar ner justerar du kamerans fokus manuellt genom att vrida fokuseringsringen på kamerans linskropp medan du tittar på skärmen (bild 3F). Det är möjligt att zooma in på maskarna med hjälp av en rullningshjulmus som möjliggör mer exakt fokusering. När du har ställt in fokus justerar du ljusratten så att displayen är så ljus som möjligt utan överexponering (visas som röda pixlar på displayen). Tryck på inspelningsknappen efter 60 s.Videon går från livevisning till inspelning och en timer visas. När fångsten är klar återgår videoinspelningsdisplayen till livevisningen (kompletterande bild 1B). Ta bort plattan efter inspelningen och ställ in nästa platta. Byt namn på prefixet efter behov. Tvätta maskar i analysplattan, inkubera i 60 s och registrera varje behandling. När du har slutfört alla inspelningar för ett experiment stänger du alla öppna videoflikar och stänger av ljuskällan genom att trycka ned dimmerratten. Stäng fönstret Videoinspelning genom att klicka på den röda x-knappen i fönstrets övre högra hörn. alternativt stänga hela programvarupaketet och öppna igen. Förbered videor för spårning. På menyn Arbetsflödes sidofält väljer du den första knappen på den här menyn, Importera bildsekvens och hittar och dubbelklickar på en video. Videon öppnas i mittenfönstret (kompletterande figur 2A).Standardvisningen för programvaran är menyn Arbetsflödes sidofält. Den här menyn kan också nås via den övre rullgardinsmenyn under Visa [Visa | Arbetsflöde]. Menyn Arbetsflöde har flera visningsalternativ. Spårvyn är lämplig i det här läget i protokollet. Om knappen Ange sekvensinformation inte visas på menyn är detta inte rätt vy. Titta först längst ned på menyn och kontrollera att fliken Arbetsflöde är aktiv, kontrollera sedan att spåra-vyn är aktiv genom att klicka på ikonen Spåra . Var menyer visas i fönstret beror på bildskärmens storlek och placeringen av andra öppnade menyer. Menyer kan flyttas genom att dra och släppa, ändra ändra på och stängas. De flesta av menyerna kan också öppnas via rullgardinsmenyn Visa . Välj Ange sekvensinformation (kompletterande bild 2B) på Arbetsflödesmenyn. I det nya menyfönstret kontrollerar du namnschemat, lägger till anteckningar och validerar metadata. Kontrollera att skalningen är korrekt inställd. Skala: 11,43 μm/pixel och Mått fylls automatiskt eftersom 1000 μm är 87 pixlar. Om kamerahöjden har justerats annorlunda än vad som föreskrivs här följer du anvisningarna i den här menyn för att uppdatera vågen. Klicka på knappen Spara . Välj Justera bild på Arbetsflödesmenyn och en ny popup-meny med namnet Bildjusteringar öppnas (Kompletterande bild 2C). Välj Mörka maskar på ljus bakgrund (ljust fält). Justera ytterligare inställningar. Rekommenderade bildbehandlingsinställningar är följande: Bakgrundsutjämning: 10, Gaussisk utjämning: 5, Fyll hål: 2, Litet objektfilter: 0 och hoppa över integralderivatsegmentering. Justera tröskelvärdet så att djuren är helt fyllda med grönt men ändå skilt från bakgrunden. Klicka på Verkställ.OBS: Det är tillåtet att plocka upp vissa objekt som inte är maskar. Välj Identifiera och spåra (kompletterande bild 2D) på Arbetsflödesmenyn.En meny visas på sidan av videon med 3 flikar: Identifiera, Spåra och reparera. Markören ser ut som ett pekfinger när du är över videovisningen. Du kan också klicka på ikonen Välj (markörpilen) i ikonmenyn längst upp till vänster i programvaran. Använd fingerväljarverktyget för att välja 3-7 maskar och klicka på knappen Identifiera maskar på fliken Identifiering .OBS: Det här valet hjälper programvaran att exakt identifiera maskar för givna förhållanden och måste göras för varje video. Efter några sekunder kommer de flesta maskarna att markeras i grönt och ha ett nummer i gult. Maskar som rör vid eller krullas upp kommer sannolikt inte att markeras; Programmet kommer dock sannolikt att hitta dem under spårning. Det finns ett alternativ för att justera identifieringsparametrarna. Standardvärdena fungerar dock bra under de flesta förhållanden. Om justeringar av identifieringsparametrarna görs, se till att vara konsekvent mellan exempel och replikat. Gå fortfarande till fliken Spårning i fönstret Identifiera och spåra (kompletterande bild 2E). Avmarkera spåra maskar i bildens kant i kontrollen Spåra parametrar. Ställ in den maxspårade hypotesen till 5. Ställ in spårningsläget på Simning.Obs: Den Max spårade hypotesinställningen justerar hur många potentiella maskspår en enda spårad mask får ha och ger programmet lite spelrum i hur exakt man spårar en enda mask utan att förlora spåret av den. 5 är en bra miljö för simning. Flytta till avsnittet Avancerade inställningar och ange följande: Bildrutor kan röra gränsen: 50, Bildrutor maskar kan överlappa: 500, Position tolerans: 0,50, Formtolerans: 0,50. Spara dessa inställningar och distribuera dem för alla videor i ett experiment (och därefter) genom att spara dem som en konfiguration.OBS: Spårfiltrering rekommenderas inte och kan enkelt göras efterbehandling, lämna. Navigera till Konfigurationshanteraren (kugghjulsikonen) längst upp till vänster i ikonmenyn. När du klickar på sidan öppnas menyn Konfigurationshanteraren . Klicka sedan på ikonen Spara (kugghjul +), ge den här konfigurationen ett namn och en beskrivning och klicka sedan på OK – knappen. Om du vill komma åt den här konfigurationen i framtiden öppnar du konfigurationsmenyn , väljer önskad konfiguration och klickar på ikonen Läs in (växla upp pil). Lägg sedan till sekvensinformation, eventuellt finjustera tröskelvärdet, och välj maskar för identifiering. Alla andra inställningar kommer att vara desamma. Klicka på Spara projekt på Arbetsflödesmenyn, verifiera sparplatsen och lägg till ett projektfilnamn (matchning av projektfilnamnet med videonamnet hjälper till med kontinuitet). Stäng videon.Dessa projekt sparas med WPR-filtypen. Upprepa för alla videor: Importera bildsekvens (2.18), Ladda sparad konfiguration (2.28.1), justera tröskelvärdet (2.23), ange sekvensinformation (2.19), identifiera maskar (2.24.1), spara projektet (2.29), stäng video. Spåra videor Om du vill spåra projektfilerna går du till arbetsflödesmenyn och klickar på ikonen Batch (mapp som innehåller masksidor) (Kompletterande figur 2F).OBS: Batchbearbetningspanelen visas (kompletterande figur 2G). Ibland är det dolt men kan nås längst ned på menyn Batch workflow . fönstret kan behöva expanderas för att se det. Klicka på knappen Lägg till under avsnittet Filmarkering på den här batchbearbetningsmenyn . Navigera till och markera alla projektfiler (.wpr) som ska bearbetas klickar du på Öppna.Menyn Batchbearbetning fylls med den markerade filsökvägen, en statusindikator och en grå förloppsindikator för varje fil. Klicka på ikonen Start (uppspelningsknapp). Notera indikatorn för gröna framsteg i den första filen. Tillåt att alla filer bearbetas. När alla filer läses som färdiga (gröna) kan programvaran stängas (kompletterande figur 2G). Om en projektfil fastnar kan du överväga att köra den upphängda filen i sig, detta löser vanligtvis problemet. Om detta inte löser problemet öppnar du projektfilen, tar bort de markerade maskarna (Detect and Track-menyn ) och väljer från en ny träningsuppsättning igen. Bearbeta sedan projektfilen igen. Reparera spår (rekommenderas)Observera: Reparation av spår kan öka spårens noggrannhet. Vanliga korrigeringar är att kombinera spår som tydligt tillhör samma mask som ses av det mänskliga ögat som, ta bort spår som inte är korrekta eller inte fångar riktiga maskdata och dela spår som är felaktigt representerade eftersom maskar rör vid (ta bort det dåliga avsnittet och kombinera spår från före och efter det dåliga avsnittet om det är praktiskt). Öppna programvaran och öppna en projektfil [Arkiv | Öppet projekt] av intresse. Klicka på Öppna och klicka på Ja för att använda den här filen. Vänta tills tidsfiltret läses in. Den bearbetade videon kommer att finnas på skärmen; maskar markeras i grönt och skisseras i gult. Använd videospelaren för att skrubba igenom eller spela upp videon. Välj Identifiera och spåra (kompletterande bild 2D) på Arbetsflödesmenyn. Växla till fliken Reparera. Aktivera markeringsmarkören genom att klicka på ikonen Väljarverktyg (markörpil). Skrubba igenom videon, hitta och välj ett maskspår och använd sedan reparationsmenyn för att skapa önskad ändring.OBS: För att strategiskt lösa de flesta problem snabbt, zooma in så att ca 1/6 av plattan är synlig, börja med området kring spår #1. Skrubba snabbt igenom videokontrollen efter maskar som mystiskt dyker upp från ingenstans, spårar var siffrorna ändras eller maskar stöter på varandra och redigerar när problem uppstår. Följ maskar i numerisk ordning från startpositionen. Skrubba fram och tillbaka för att följa varje mask efter behov tills hela plattan är reparerad. Var uppmärksam på plattans kanter; ofta förekommer falska maskar i skuggorna av plåtkanter. Dataanalys Välj Analysera data (kompletterande bild 3A) på Arbetsflödesmenyn.OBS: Ett nytt fönster med namnet Dataanalys och plottning visas (kompletterande figur 3B). Det här fönstret har många sätt att bedöma och visa rörelsedata för en viss projektfils maskpopulation. De flesta av dessa analyser möjliggör val av specifika, flera eller alla maskar från en viss video som gör det möjligt att rita spårinformation på olika sätt. Om du vill analysera antalet varv navigerar du till spårsammanfattningen [Position & Speed | Spåra sammanfattning] (kompletterande figur 3C). Använd knappen Exportera längst ned till höger för att exportera data i ett läsbart kalkylbladsformat (.csv), välj en sökväg till önskad plats för kalkylbladet, inklusive att byta namn på dem till något minnesvärt. Standardinställningarna är ett bra val (kompletterande figur 3D). Klistra in dessa data, liksom andra relevanta projektdatauppsättningar i en konsoliderad kalkylbladsarbetsbok (kompletterande figur 3E). Använd turn count och track duration för att beräkna varv per min för varje spår med hjälp av kalkylbladsfunktioner (=varv/spårlängd * 60) eller använd ett annat mått efter önskemål (kompletterande figur 3F).OBS: Varv per minut fångar mycket liknande information som en manuell thrashing-analys som är ett allmänt använt mått på aktivitet i vätska, men det finns många alternativ, och det är ganska möjligt att ett annat mått kan identifiera andra intressanta data för en viss behandling eller jämförelse. Om så önskas, skärm för maskstorlek, spårlängd och/eller andra valda mått med hjälp av verktyg för villkorsstyrd formatering för att markera spår för borttagning om de kan vara förvirrande. Upprätthålla konsekvent databehandling mellan behandlingar och replikat. Analysera data med hjälp av lämpliga statistiska analyser som Students t-test för 2 stammar, eller 1-vägs ANOVA för 3 eller fler stammar. Utför oberoende experimentella replikat på olika dagar och med oberoende populationer av maskar för minst 3 oberoende experimentella replikat.

Representative Results

Både radiell rörelse och simanalyser erbjuder känslig detektion av nedsatt rörlighet (figur 4 och figur 5). För att undersöka mekanismerna bakom patologiska TDP-43 i ALS, C. elegans modeller har utvecklats som uttrycker wild-typ eller ALS-mutant mänskliga TDP-43 pan-neuronally. Dessa djur uppvisar molekylära och cellulära egenskaper som påminner om ALS, inklusive motorisk dysfunktion9. Viktigt, de uppvisar måttlig motility nedskrivningar med uttrycket av vilda-typ mänskliga TDP-43 och allvarligare motility nedskrivningar hos djur som uttrycker ALS-mutant TDP-43 med hjälp av både radiell rörelse och simning analyser. Vissa muterade eller transgena djur kommer att ha större försämring i krypning än simning, eller vice versa. Genom att använda två olika motilitetsanalyser erhålls en tydligare bild av fenotypiska skillnader mellan stammar. Radiell rörelseNär C. elegans placeras på en sådd agarplatta utforskar de sin omgivning, bland annat genom att söka efter gränserna för sin matkälla. Radiella rörelseanalyser är ett sätt att dra nytta av det beteendet som ett mått för fysisk kondition. Genom att analysera det lokomotoriska beteendet (krypa på en fast yta) på ett kontrollerat och kvantifierbart sätt, erbjuder den radiella lokomotoriska analysen ett enkelt och effektivt verktyg för att bedöma svårighetsgraden av motoriska underskott och andra motorrelaterade fenotyper. Radiella rörelseanalyser fångar skillnader i motilitet i måttligt eller allvarligt nedsatt ALS-modellmaskar och erbjuder en baslinje för att jämföra modulering av motilitetsfenotyper eller förändringar i motilitet med ålder (figur 6). Den här strategin kan tillämpas för att kvantifiera crawlningsbeteendet hos alla stammar som har ändrat rörelse från vilda typer (N2) eller kontrollmaskar. Denna metod kanske dock inte är ett bra val för att bedöma djur som inte kan krypa normalt, såsom rullmutanter eller djur som är förlamade. Vanligtvis uppvisar maskar av vild typ en genomsnittlig förskjutning mellan 200-300 μm/min när de höjs och testas vid 20 °C. De exempeldata som presenteras i figur 4 visar förväntade resultat som jämför N2, två olika transgena stammar som uttrycker vilda mänskliga TDP-43 med en mild fenotyp [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller starkare fenotyp [TDP-43(WT-måttlig), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], en transgen stam som uttrycker mutant människa TDP-43 med en allvarlig fenotyp [TDP-43(M337V), CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]) och en transgen stam som uttrycker ett annat neurodegenerativt sjukdomsassocierat protein, vildtyp human tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. De två stammar som uttrycker vilda-typ TDP-43 har olika grader av nedskrivning som detekteras av radiell rörelse. TDP-43 (WT-low) skiljer sig inte nämnvärt från N2, medan TDP-43 (WT-high) uppvisar tydliga skillnader i motilitet. TDP-43(M337V) och tau (WT) stammar har svårare nedskrivningar i motilitet. Simning analysC. elegans ägnar sig åt stereotyp simning (thrashing) rörelse när den är nedsänkt i vätska. Omedelbart vid nedsänkning börjar maskar karakteristiskt böja huvud och svans mot varandra med en böjvinkel på cirka 45°, med vinkelhörnet som mitten av masken. Maskar växlar böjning i ventrala och dorsala riktningar. En thrash, mätt av programvaran, representerar rörelsen av att gå från rak till en kroppsböjningsvinkel på 20° eller högre, oavsett riktning (vinkeltröskel kan justeras efterbehandling inom analys- och plottningsfönstret [Arbetsflöde | Analysera data | Kroppsform | Böjvinkel | Mittpunkts-| Amplitudtröskel: # grader]. Simanalysen som beskrivs här använder automatiserad datorbaserad spårning och analys för att ge opartisk poängsättning av simaktivitet. Det förväntas att maskar av vild typ (N2) i genomsnitt kommer att mellan 150-200 thrashes per min när de höjs och registreras vid 20 °C. Exempeldata som presenteras i figur 5 visar förväntade resultat som jämför N2, två olika transgena stammar som uttrycker vilda mänskliga TDP-43 med en mild fenotyp [TDP-43(WT-mild), CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])] eller starkare fenotyp [TDP-43(WT-måttlig), CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])], och en transgen stam som uttrycker ett annat neurodegenerativt sjukdomsassocierat protein, vildtyp human tau [tau(WT), CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]. Den transgena stammen som uttrycker ALS-mutant TDP-43 [TDP-43(M337V)] thrash inte i vätska, och därför betecknas det på diagrammet som ND (inga data). Denna analys kan diskriminera andra fenotyper än den radiella rörelsetest som visas i figur 4. Till exempel, i den radiella rörelse analysen (figur 4), TDP-43 (WT-low) var inte signifikant annorlunda än N2. I simanalysen (figur 5) skiljer sig dock både TDP-43 (WT-low) och TDP-43 (WT-high) avsevärt från N2, liksom betydligt skiljer sig från varandra. Trots att både TDP-43 (M337V) och tau(WT) har allvarliga krypningssvårigheter genom radiell rörelse (figur 4), kan endast tau (WT) slå tillräckligt för att spåras av programvaran (figur 5). TDP-43(M337V) djur kan inte slå, och mjukvarubaserad analys upptäcker eller spårar inte dessa maskar exakt. Således samlades data om dessa maskar inte in (ND, inga data). Bild 1: Radiell rörelseanalysarbetsflöde. Panel A-E visar de generaliserade stegen i den radiella rörelseanalysen. Stegen är följande: (A) NGM-plattor, med OP50 sådda till kanterna, bereds genom märkning och märkning av central punkt, (B) maskar placeras i mitten av agaren som markeras av den centrala pricken, (C) maskar får röra sig fritt under en viss tid, (D) plattan vänds nedifrån och den slutliga platsen för varje mask är markerad i en annan färg än den centrala pricken, (D) plattan vänds nedifrån och den slutliga platsen för varje mask är markerad i en annan färg än den centrala pricken, (E) Avståndet från mittpunkten till varje slutlig maskplats mätt antingen för hand eller digitalt. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 2: Digital mätning av slutlig plats med ImageJ.  Avståndet från mittmätningarna kan mätas för hand eller digitalt, för att mäta digitalt med ImageJ (A) skanna baksidan av plattan med en linjal i ramen. (B) Rita en känd längd med linjeverktyget. (C) Använd den kända längden ritad i (B) för att ange skala [Analysera | Ställ in skala…]. (D) Använd linjeverktyget för att rita en linje från mittpunkten till ett slutligt platsmärke, upprepa för varje markering. (E) En pensellinje som markerar det första märket mätte hjälpmedel vid poängsättning (snirkligt svart linje nära 1-märket). De slutliga placeringsmarkeringarna numreras i gult för att illustrera poängsättningens riktning. F) Mätningar registreras i resultatfönstret. Spara resultat någon annanstans för statistisk analys. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 3: Material- och hårdvarujusteringar för användning av programvaran. (A) Material som används för den programvaruassisterade simanalysen. (B) Allmän inställning av programvaran och nödvändiga material, observera att höljet är i upphöjt läge. (C) Linsmonteringsfästets höjd kan justeras. Den här bilden visar det justerbara spåret och en tejpindikator som markerar önskad höjd för att utföra simanalyser. Det är nödvändigt att justera brightfield-ljuset och kamerafokuset före inspelningen. D) En 35 mm analysplatta placeras på scenen, djur i M9 läggs till på plattan och en 1 min timer startas. (E) Det är ibland fördelaktigt att försiktigt virvla plattan för att flytta maskar närmare mitten – observera platsen på live-fångstskärmen; Alternativt kan några droppar M9 från en pipettor användas för att separera maskar. (F) Justera fokusringen på kameralinsen, observera maskar på skärmen för att bestämma optimalt fokus. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 4: Radiella rörelseanalyser upptäcker skillnader i krypningshastighet. Ostimulerad spridning av utvecklingssteg L4 larver mättes med hjälp av den radiella rörelse analysen som beskrivs ovan och graferas som μm/min reste (A-B). Samma data som ritas i (A) och (B) visar två olika möjliga grafiska presentationer. I (A) visas data som ett stapeldiagram, vilket gör relativa skillnader mellan stammar tydligare. I (B) placeras den slutliga förskjutningen av varje mask i diagrammet, vilket gör att variationen inom populationen kan visualiseras bättre. För att utvärdera betydelsen bland testade stammar användes envägsanalys av varians (ANOVA) med Tukeys multipla jämförelsetest. **p=0,0022, ****p<0,0001, ns=inte signifikant. TDP-43(M337V) och tau(WT) skiljer sig också avsevärt från N2, s<0.0001. Felstaplar i (A) är standardfel för medelvärdet (SEM) och i (B) är standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 5: Simanalyser detekterar skillnader i thrashing i vätska. Simhastigheter (thrashing eller böljande frekvens i vätska) mättes med hjälp av opartisk datorstödd poängsättning och analys som beskrivs ovan och graferades som thrashes/min (A-B). Samma data som ritats i (A) och (B). I (A) diagram överss data som ett stapeldiagram, vilket gör relativa skillnader mellan stammar lättare att se. I (B) ritas data från varje enskild mask som poängsatts i diagrammet, vilket gör att variationen inom populationen kan visualiseras bättre. För att utvärdera betydelsen bland testade stammar användes en enkelriktad analys av variansen (ANOVA) med Tukeys multipla jämförelsetest. p<0.0001, ns=inte signifikant. TDP-43(WT-måttlig) och tau(WT) skiljer sig också avsevärt från N2, p<0.0001.Felstaplar i (A) är standardfel för medelvärdet (SEM) och i (B) är standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 6: Mutanta TDP-43 maskar färdas mindre än maskar av vild typ. Skyltar som visar en representativ skillnad i den slutliga placeringen av Iscensatt L4 N2 (vild typ) och TDP-43(M337V) (CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP]), en stam som uttrycker mutant människa TDP-43 med allvarligt nedsatt motorisk funktion efter 1 timmes ostimulerad krypning vid rumstemperatur. Plattor är markerade med en röd punkt för mittpunkten och blå prickar för djurens slutliga plats. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Kompletterande figur 1: Registrera simbeteende med hjälp av bild- och spårningsprogramvaran. (A) Spårningsarbetsflödet och platsen för videoinspelningsikonen. (B) Videoinspelningsfönstret visas i livevisning och de viktigaste aspekterna markeras. De gröna “Live view”-orden ändras till en röd “Inspelning” när inspelningsknappen aktiveras. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur 2: Förbereda och spåra simbeteende. Den här figuren visar en serie skärmdumpar för att hjälpa till att ställa in en videobildsekvens för spårning. Det allmänna protokollet för att förbereda en videosekvens är att öppna varje arbetsflödesmeny i den här ordningen: Importera bildsekvens | Ange | Justera bild | Identifiera och spåra | Spara projekt. Fönstret Analysera data kan bara användas när en projektfil har spårats. (A) visar en öppnad .avi (video) efter att sekvensen har importerats till programvaran inifrån Arbetsflödet Spåra . (B) Fönstret Ange sekvensinformation innehåller en plats för anteckningar, ställa in/ändra skalan och kontrollera metadata för en videosekvens. Instruktioner för att ändra skalan finns i det här fönstret och bör följas när kameran sänks eller höjs (B). Bild (C) visar inställningarna för fönstret Justera bild . (D) Skärmbild som visar fliken identifiering i fönstret Identifiera och spåra . Att upptäcka maskar används för att träna programvaran och måste ställas in för varje videosekvens. Ytterligare identifieringsparametrar kan ställas in här om så önskas. (E) Skärmbild av fliken Spårning i fönstret Upptäck och spåra med rekommenderade inställningar för att spåra simbeteende. Detta är det sista steget i att konfigurera en videosekvens. Spara sekvensen som ett projekt med hjälp av fönstret Spara projekt . Upprepa dessa steg för varje videosekvens. Inställningar kan sparas som en konfiguration för att minska arbetsbelastningen och se till att alla sekvenser behandlas på samma sätt (visas inte). Om du vill spåra projektfiler för analys navigerar du till batcharbetsflödet . (F) visar ikonen som används för att navigera till batcharbetsflödet och (G) visar batchbearbetningsfönstret, markerar tilläggs- och startknapparna och visar det förväntade utseendet på en projektfil som har spårats. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur 3: Analys av simbeteende. När en projektfil har spårats kan den öppnas med [Arkiv | Öppna projekt]. Maskar visas i grönt enligt (A). Skrubbning genom videon ger en snabb kontroll av att videon bearbetas som förväntat, grön markering kommer att försvinna medan du skrubbar. Fönstret Dataanalys och plottning öppnas från arbetsflödesobjektet Analysera data . (B) visar fönstret Dataanalys och plottning med positionsvyn öppen (standard), alla spår markeras. Under datapunkterna finns en plot som visar det inspelade spåret för varje markerad mask. Spårsammanfattningsanalysen används för att beräkna varv per minut. (C-D) visa spårsammanfattningsrapporten och exportinformation. (E-F) visa spårsammanfattningen i ett kalkylblad och hur man beräknar varv per minut, den utdata som mäts i denna analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Radiell rörelse:
Upplösningen av denna analys styrs enkelt genom att ändra tidsvariabeln. Att öka tiden gör det lättare att observera skillnader mellan djur med svåra fenotyper och därigenom identifiera subtila skillnader. Men eftersom denna analys mäter förskjutning, om analystiden förlängs för länge, kommer djur med normal motilitet, såsom N2, att resa till kanterna på plattan, och födosöksbeteende kommer att leda till backtracking. Detta kommer på konstgjord väg att minska mätningen av tillryggalagda avstånd. Tidsperioder som är för långa kan leda till att skillnader mellan stammar försvinner, särskilt mellan djur med mindre allvarliga motorfenotyper, eftersom djur blir jämnt spridda över plattan. Om du förkortar tidsvariabeln förhindras att mer aktiva maskar hittar plattans kanter. Denna metod spårar inte den totala tillryggalagda sträckan för varje mask utan komprimerar avståndet för varje tillryggagiven mask till ett linjärt avstånd från mitten av plattan. Som sådan är den i sig mindre robust än en metod som registrerar den totala spårlängden för enskilda maskar. Den radiella rörelseanalysen kräver dock mycket lite forskarutbildning, använder relativt prisvärda reagenser som är vanliga i de flesta masklaboratorier och är tillräckligt känsliga för att producera betydande och reproducerbara resultat. För labb som föredrar automatiserad videospårning har flera metoder tidigare etablerats för att spåra och analysera ^{crawlningsrörelser12}, eller de programvaruparametrar som används för simanalysen i detta dokument kan ändras för att möjliggöra crawlningsdetektering och analys.

Detta experiment görs vanligtvis i tre exemplar oberoende replikat, med en uppsättning av 30-40 maskar per replikat. Varje replikat delas upp på två olika 100 mm eller 150 mm plattor, med 15-20 maskar per tallrik. Att använda fler maskar än rekommenderat per tallrik kan göra det svårt att göra mål effektivt. Ett totalt antal poäng på 90+ är tillräckligt drivna för att fastställa betydelse för mild, måttlig eller svår motilitet nedskrivning. Att vara konsekvent med timing mellan stammar poäng är avgörande för noggrannhet och reproducerbarhet. 30 minuter är i allmänhet tillräckligt länge för att fastställa skillnader mellan måttliga till svåra fenotyper såsom transgena stammar som uttrycker human mutant TDP-43 jämfört med maskar av vild typ (figur 4). Om tidsvariabeln kommer att förlängas är det lämpligt att också öka plattans storlek från 100 mm till 150 mm. Miljöfaktorer som temperatur och luftfuktighet kan påverka denna analys, som vanligtvis utförs vid rumstemperatur, så det är viktigt att alltid använda en kontroll av vildtyp (N2) när du jämför mellan replikat. Dessutom kan denna analys mäta motiliteten hos vissa stammar som inte uppvisar normalt simbeteende i vätska (thrashing), vilket gör det till ett användbart komplement till simanalysen.

Simning analys:
Användningen av bild- och förvärvssystemet för att automatisera spårning och analys av masksimning möjliggör rigorösa och opartiska data. Det finns dock flera faktorer under den första installationen av experimentet som måste kontrolleras mellan proverna. Dessa inkluderar tiden att acklimatisera sig till vätska innan inspelningen påbörjas, omgivningsförhållanden (dvs. temperatur, luftfuktighet) och konsekventa ljus- och inspelningsinställningar. På inspelningsstadiet finns det flera funktioner som hjälper till att minska variationen mellan plattorna. Dessa inkluderar en integrerad spårmonterad kamera och ljusfältssteg som gör inspelningsvideo konsekvent mellan plattor, skärmning runt scenen som förhindrar reflektioner, bländning och luftrörelser under inspelning och ett robust mjukvarupaket som på ett tillförlitligt sätt upptäcker maskar och möjliggör manuell korrigering av spår i videoefterbehandling. I detta protokoll spelas videor av en 35 mm platta med maskar in i 1 minut och bearbetas sedan med hjälp av programvarupaketet. Efter bearbetning säkerställer manuell korrigering av spår att maskbeteenden registreras korrekt utan att förvirra spårningsfel. Rösträknings- och spårvaraktighetsdata används för att bestämma varv per minut som en slutlig avläsning. För att säkerställa reproducerbarhet samlas data in under minst 3 oberoende replikatexperiment, var och en med 40–50 poängsatta djur, för att uppnå ett kombinerat slutligt antal djur 120-150. Detta antal är tillräckligt för att diskriminera små skillnader i simning beteende från kontrollmaskar. Vissa maskar har motoriska underskott som är för allvarliga för att fångas upp av simanalyser. Till exempel, om djuren placeras i en flytande medium curl istället för att utföra det förväntade thrashing svaret, kommer denna analys inte att registrera dessa rörelser exakt och en annan rörelseanalys, såsom radiell rörelse, kan bättre fånga dessa motilitetsdefekter. Det angivna protokollet använder ett kommersiellt tillgängligt bildsystem (se Tabell över material för mer information), men andra maskspårningssystem kan ge ett liknande verktyg, varav vissa är öppen ^källkod12. Tidigare publicerade metoder beskriver manuell poängsättning av mask ^thrashing13. Medan den automatiserade analysen producerar ett antal mätvärden för varje enskild mask, ger detektion av kroppsböjningar som mäts i thrashes per minut konsekventa resultat mellan experiment och spår väl med konventionell poängsättning av maskthrashes med öga.

Materials

C. elegans	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	–	Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain
Disposable pasteur pipets, borosilicate glass	VWR	14673-010	Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.
Disposable petri dishes, 35x10mm	VWR	10799-192	Assay plates for WormLab Imaging System
Disposable petri dishes, 60x15mm	VWR	25384-090	Stock plates for worms
Disposable petri dishes, 100x15mm	VWR	25384-302	Standard radial locomotion assay plate
Disposable petri dishes, 150x15mm	VWR	25384-326	Longer time frame radial locomotion assay plate
Dissecting microscope	Leica	M80	Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays
Fine-tipped markers	VWR	52877-810	Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy.
Flatbed Scanner	Amazon	Epson Perfection V850	Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine
ImageJ	NIH	–	Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/
M9 buffer	VWR	IC113037012	Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
NGM (Nematode Growth Medium)	VWR	76347-412	Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans
OP50  bacteria	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Primary food source for C. elegans
p1000 pipettor	VWR	76207-552	Pipettor, used in swimming assay
p1000 tips	VWR	83007-384	Tips for pipettor, used in swimming assay
Platinum wire, 0.2032mm diameter	VWR	BT136585-5M	Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join.
Ruler	VWR	56510-001	Need to score radial locomotion assays
WormLab Imaging System	MBF Bioscience	WormLab	The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system