המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ”ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.
פרוטוקול זה מתאר את העיצוב של תבנית DNA מינימלית ואת השלבים להגברה אנזימטית, המאפשרת טיפוס מהיר של חלבונים הניתנים לבדיקה בפחות מ-24 שעות באמצעות חופש הביטוי של התא. לאחר קבלת DNA מספק, שבר הגן הוא PCR מוגבר, לחתוך, מעגלי, ו cryo-בנקאות. כמות קטנה של ה- DNA הבנקאי מדוללת ומוגברת באופן משמעותי (עד 106x) באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל (RCA). RCA יכול להניב כמויות מיקרוגרם של תבנית הביטוי המינימלית מרמות פיקוגרמה של חומר התחלתי (רמות מ”ג אם נעשה שימוש בכל הקטע הסינתטי ההתחלתי). בעבודה זו, כמות התחלתית של 20 pg הביא 4 מיקרוגרם של המוצר הסופי. ניתן להוסיף את מוצר RCA המתקבל (ויתור על התבנית המינימלית) ישירות לתגובה נטולת תאים ללא שלבי טיהור. בשל שיטה זו להיות מבוסס PCR לחלוטין, זה עשוי לאפשר מאמצי סינון תפוקה גבוהה בעתיד בשילוב עם מערכות טיפול נוזלי אוטומטי.
ביטוי גנים ללא תאים (CFE) הופיע ככלי רב עוצמה עם יישומים רבים. יישומים כאלה כוללים גילוי מחלות1,2,3,4,5,6, מיקרונוטריאנט וזיהוי מולקולות קטנות7,8,9,10,11,12, biomanufacturing13,14,15,16,17 ,18, חינוך19,20,21, ייצור חלבונים קשים17,22,23,24,25,26,27, והקרנהמשתנה 23,28,29,30,31,32 ,33. זאת בשל האופי הפתוח של מערכות ללא תאים והגמישות שהן מעניקות. מאמרי סקירה גדולים רבים מציעים חינוך היסטורי ונקודות מבט עתידיות על הטכנולוגיה34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.
תגובה טיפוסית ללא תאים מורכבת משלושה מרכיבים עיקריים: תמצית תאים, תערובת אנרגיה ותבנית גנטית. תמצית תא פעיל מכיל את כל המכונות הדרושות עבור שעתוק ותרגום (TXTL) וניתן לעבד במגווןדרכים 36. מתווכים גליקוליטיים, אלקטרוליטים, חומצות אמינו וקופות פחמן מתמהיל האנרגיה תומכים בתהליך TXTL. זהו מקור עיקרי של שונות בניסויים ללא תאים45 והוא יכול להיות מוכן במובנים רבים34,46. הכנת התבנית הגנטית ראתה פחות שיפורים מאז שיטות שיבוט מסורתיות לגרום plasmids עם מאפייני ביטוי מעולה. החיסרון בשיטות מסורתיות אלה הוא זמן התפנית וכמות המומחיות הביולוגית הדרושה כדי לבנות ולהפיץ אותם. מאמצי אופטימיזציה אחרונים הביאו זרימות עבודה פשוטות של 24 שעות להכנת תמצית תאים47,48 שניתן לבצע במקביל להכנת תערובתאנרגיה 49,50. עם זאת, שיבוט מסורתי מוסיף ימים מרובים לציר הזמן של עיצוב-טיפוס של CFE(טבלה 1)23. ניתן להשתמש במוצרי PCR מוגברים במהירות מרסיס הגן המסחרי ישירות51, אך זה מגביל את מספר ניסויי האב-טיפוס שכן מיוצר רק מיקרוגרם אחד של DNA, אשר מתאים לכחמש תגובות (כרכים μL מסורתיים). עם שלבים נוספים אלה של סיבובי הגברה איזותרמית, גדול יותר מכמויות מיליגרם של ה- DNA אפשרי (~ 5,000 תגובות עבור 1 מ”ג). זה מגדיל באופן דרמטי את מספר הבדיקות שניתן לבצע בהקרנה בתפוקה גבוהה של חלבונים או רשתות אנזימים קומבינטוריות (הנדסה מטבולית ללא תאים); זה גם מאפשר שימור יעיל של ספריית התבניות הליניארית כדנ”א בריכוז גבוה. יתר על כן, כמות מוגברת של תבנית יהיה צורך אב טיפוס כמויות גדולות יותר של חלבון הדרוש עבור יישומי מדעי החומר (סיבים מבוססי חלבון הידרוג’ל). ניתן להתגבר על מגבלות מסוימות של תבניות ליניאריות באמצעות תמצית מ- BL21 DE3 Star או באמצעות שיטות שהתגלו לאחרונה כדי להגן על תבניות ליניאריות מפני השפלה52,53,54. עם זאת, אין זה מתייחס למלאי מוגבל של DNA המיוצר על ידי ספק להגברת PCR או לנושא המומחיות הביולוגית והציוד הדרוש לשיבוט.
עבודה זו מציגה פרוטוקול שתוכנן במפורש כדי להגדיל את כמות תבנית הביטוי שניתן להשיג מכמויות קטנות של שברי גנים המיוצרים על ידי ספק (בדרך כלל 500-1000 ננוגרם של אבקת ליופילים). השיטה המתוארת אינה דורשת את הכישורים הדרושים לביצוע שיבוט מסורתי ב plasmids או שינוי והתפשטות בתאים חיים. עם קבלת שבר גנים בדואר, משתמש יכול לייצר מספיק תבניות עבור תגובות רבות ללא תאים על ידי שימוש בהגברת מעגל מתגלגל איזותרמי (RCA) (איור 1)23. בעוד שכמות הדנ”א המתקבלת מהספק עשויה להספיק למאמצי סינון מוגבלים, היא מתרוקנת במהירות, ורכישת שברי גנים מחדש גוזלת זמן ויקר. השיטה גם מתאימה במיוחד לגנים רעילים וקשה לשכפול ב- E. coli.
גן העניין יכול להיות כל חלבון רצוי, אבל עדיף להתחיל עם חלבון פלואורסצנטי ככתב נוח לקריאה בזמן אמת או נקודת קצה על קורא צלחת היטב עבור מאמצים חדשים של שיטה זו. עבור רצפי חלבון חדשים, להעתיק את רצף חומצת האמינו של החלבון הרצוי ולהדביק אותו לתוך כלי אופטימיזציה קודון הרצוי61,…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מכירים NIH 1R35GM138265-01 ו- NSF 2029532 לתמיכה חלקית בפרויקט זה.
Alaline | Formedium | DOC0102 | |
Ammonium glutamate | MP Biomedicals | MP21805951 | |
Arginine | Formedium | DOC0106 | |
Asparagine | Formedium | DOC0114 | |
Aspartic Acid | Formedium | DOC0118 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Axygen Sealing Film | Corning | PCR-SP | |
CMP | Sigma | C1006 | |
Coenzyme A | Sigma | C3144 | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | Provided with HindIII |
Cysteine | Formedium | DOC0122 | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4004 | Used for purifying DNA |
dNTPs | NEB | N0447 | |
E. coli tRNA | Sigma (Roche) | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma | 47612 | |
Gene Fragment | IDT | ||
Glutamic Acid | Formedium | DOC0134 | |
Glutamine | Formedium | DOC0130 | |
Glycine | Formedium | DOC0138 | |
GMP | Sigma | G8377 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
HindIII-HF | NEB | R3104L | |
Histidine | Formedium | DOC0142 | |
Isoleucine | Formedium | DOC0150 | |
Leucine | Formedium | DOC0154 | |
Lysine | Formedium | DOC0158 | |
Magnesium glutamate | Sigma | 49605 | |
Methionine | Formedium | DOC0166 | |
Microtiter Plate (384 well) | Greiner | 781906 | |
Microtiter Plate (96 well) | Greiner | 655809 | |
Multimode Plate Reader | BioTek | Synergy Neo2 | |
NAD | Sigma | N8535 | |
NanoPhotometer | Implen | NP80 | |
OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480 | |
PCR Tube | VWR | 20170-012 | |
Phenylalanine | Formedium | DOC0170 | |
Phosphoenolpyruvate | Sigma (Roche) | 10108294 | |
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | |
Potassium oxalate | Fisher Scientific | P273 | |
Proline | Formedium | DOC0174 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Serine | Formedium | DOC0178 | |
Spermidine | Sigma | S0266 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with T4 DNA Ligase |
TempliPhi Amplification Kit | Cytiva | 25640010 | Used for RCA |
Thermal Cycler | Biorad | C1000 Touch | |
Thermoblock | Eppendorf | ThermoMixer FP | |
Threonine | Formedium | DOC0182 | |
Tryptophan | Formedium | DOC0186 | |
Tyrosine | Formedium | DOC0190 | |
UMP | Sigma | U6375 | |
Valine | Formedium | DOC0194 |