JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Быстрые ферментативные методы амплификации минимальных линейных шаблонов для прототипирования белка с использованием бесклеточных систем

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62728
,
1Chemical and Biological Engineering,Iowa State University

Summary

В исследовании описывается протокол создания больших (мкг-мг) количеств ДНК для кампаний скрининга белка из синтетических фрагментов генов без клонирования или использования живых клеток. Минимальный шаблон ферментативно переваривается и циркулируется, а затем усиливается с помощью изотермического усиления скользящего круга. Реакции бесклеточной экспрессии могут быть выполнены с неочищенным продуктом.

Abstract

Этот протокол описывает разработку минимального шаблона ДНК и этапы ферментативной амплификации, что позволяет быстро создавать прототипы анализируемых белков менее чем за 24 ч с использованием бесклеточной экспрессии. После получения ДНК от поставщика фрагмент гена амплифицируется ПЦР, разрезается, циркуляризируется и криобанкируется. Небольшое количество хранимой ДНК затем разбавляют и значительно амплируют (до 106 х)с помощью изотермической амплификации скользящего круга (RCA). RCA может давать микрограммовые количества минимального шаблона экспрессии из пикограммных уровней исходного материала (уровни mg, если используется весь исходный синтетический фрагмент). В этой работе начальное количество 20 пг привело к 4 мкг конечного продукта. Полученный продукт RCA (конкатемер минимального шаблона) может быть добавлен непосредственно в бесклеточную реакцию без этапов очистки. Поскольку этот метод полностью основан на ПЦР, он может обеспечить будущие высокопроизводительные усилия по скринингу в сочетании с автоматизированными системами обработки жидкостей.

Introduction

Бесклеточная экспрессия генов (CFE) стала мощным инструментом со многими приложениями. Такие приложения включают обнаружение заболеваний1,2,3,4,5,6,обнаружение микроэлементов и малых молекул7,8,9,10,11,12,биопроизводство13,14,15,16,17 ,18, образование19,20,21, производство сложных белков17,22,23,24,25,26,27, и вариантскрининга 23,28,29,30,31,32 ,33. Это связано с открытой природой бесклеточных систем и гибкостью, которую они предоставляют. Многие замечательные обзорные статьи предлагают историческое образование и будущие перспективы технологии34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Типичная бесклетовая реакция состоит из трех основных компонентов: клеточного экстракта, энергетического микса и генетического шаблона. Экстракт активных клеток содержит все необходимые механизмы для транскрипции и трансляции (TXTL) и может быть обработан различными способами36. Гликолитические промежуточные продукты, электролиты, аминокислоты и кофакторы в энергетическом балансе поддерживают процесс TXTL. Он является основным источником изменчивости в бесклеточных экспериментах45 и может быть получен многими способами34,46. Подготовка генетического шаблона показала меньше улучшений, поскольку традиционные методы клонирования приводят к плазмидам с отличными характеристиками экспрессии. Недостатком этих традиционных методов является время обработки и количество биологических знаний, необходимых для их создания и распространения. Недавние усилия по оптимизации привели к простым 24-часовым рабочим процессам для подготовки экстракта клеток47,48, которые могут выполняться параллельно с подготовкой энергетического баланса49,50. Однако традиционное клонирование добавляет несколько дней к временной шкале прототипирования CFE(таблица 1)23. Быстро амплифицированные продукты ПЦР из коммерческого фрагмента гена могут быть использованы непосредственно51,но это ограничивает количество экспериментов по прототипированию, так как производится только 1 мкг ДНК, что соответствует примерно пяти реакциям (традиционные объемы 15 мкл). С этими дополнительными этапами циркуляризации и изотермической амплификации возможны количества ДНК, превышающие миллиграммы (~ 5000 реакций на 1 мг). Это резко увеличивает количество тестов, которые могут быть сделаны при высокопроизводительном скрининге белков или комбинаторных ферментных сетей (бесклеточная метаболическая инженерия); это также позволяет эффективно сохранять библиотеку линейных шаблонов в виде ДНК высокой концентрации. Кроме того, для прототипирования большего количества белка, необходимого для применения в материаловедении (белковые волокна и гидрогели), потребуется увеличение количества шаблона. Некоторые ограничения линейных шаблонов можно преодолеть, используя выдержку из BL21 DE3 Star или используя недавно открытые методы защиты линейных шаблонов от деградации52,53,54. Однако это не касается наличия ограниченных запасов ДНК, производимой поставщиками для амплификации ПЦР, или вопроса о биологическом опыте и оборудовании, необходимом для клонирования.

В этой работе представлен протокол, явно предназначенный для увеличения количества шаблона экспрессии, который может быть получен из небольших количеств фрагментов генов, продуцируемых поставщиком (обычно 500-1000 нг лиофилизированного порошка). Описанный способ не требует навыков, необходимых для выполнения традиционного клонирования в плазмидах или преобразования и распространения в живых клетках. Получив фрагмент гена по почте, пользователь может создать достаточно шаблонов для многих бесклеточных реакций, используя изотермическую амплификацию скользящего круга (RCA)(Рисунок 1)23. Хотя количество ДНК, полученное от поставщика, может быть достаточным для ограниченных усилий по скринингу, оно быстро истощается, а повторная покупка фрагментов генов занимает много времени и стоит дорого. Метод также особенно хорошо подходит для генов, которые токсичны и трудно клонируются у кишечной палочки.

Protocol

1. Проектирование фрагмента гена ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагмент гена должен иметь все необходимые генетические элементы для транскрипции/трансляции, включая промотор, сайт связывания рибосом (RBS), стартовый кодон, интересующий ген и терминатор. Хотя терминатор не нужен для шаблона ?…

Representative Results

Экспрессия sfGFP из шаблонов RCA была сопоставима с экспрессией плазмиды pJL1 при использовании только 0,30 мкл неочищенной RCA-ДНК в реакции 15 мкл(рисунок 2A). Фактически, удвоение и утроение количества шаблона, по-видимому, не приносит никакой пользы в экстракте BL21 DE3 Star, предпола…

Discussion

Интересующим геном может быть любой желаемый белок, но лучше всего начать с флуоресцентного белка в качестве удобного репортера для считывания в режиме реального времени или конечной точки на считывателе пластин для новых пользователей этого метода. Для новых белковых последовательн…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают, что NIH 1R35GM138265-01 и NSF 2029532 для частичной поддержки этого проекта.

Materials

Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of “difficult-to-express” proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. . Addgene: pJL1 Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021)
  56. . IDT Codon Optimization Tool Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021)
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
  58. . New England Biolabs Tm Calculator Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021)
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Tags

Cell-free SystemsProtein PrototypingRolling Circle AmplificationPCRDNA TemplateRestriction DigestionDNA LigationEnzymatic Amplification
check_url/62728?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image