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Abstract
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Bioengineering

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62728
,
1Chemical and Biological Engineering,Iowa State University

Summary

この研究は、クローニングや生きている細胞を使用せずに、合成遺伝子断片からタンパク質スクリーニングキャンペーンのための大量(μg-mg)量のDNAを作成するためのプロトコルを記述しています。最小のテンプレートは酵素的に消化され、円形化され、等熱転がり円増幅を使用して増幅される。無細胞発現反応は、非精製物で行うことができる。

Abstract

このプロトコルは、最小DNAテンプレートの設計と酵素増幅のステップを説明し、無細胞発現を用いて24時間未満でアッセイ可能タンパク質の迅速なプロトタイピングを可能にする。ベンダーからDNAを受け取った後、遺伝子断片はPCR増幅、切断、円形化、およびクライオバンクされる。少量のバンクDNAは、等温転環増幅(RCA)を使用して、希釈され、有意に増幅されます(最大106x)。RCAは、出発物質のピコグラムレベル(すべての開始合成フラグメントが使用されている場合はmgレベル)から最小発現テンプレートのマイクログラム量を得ることができます。この作業では、20 pgの開始量は最終製品の4 μgをもたらしました。得られたRCA製品(最小鋳型の連結物)を、精製工程なしで無細胞反応に直接添加することができる。この方法は完全にPCRベースであるため、自動液体処理システムと組み合わせることで、将来のハイスループットスクリーニングの取り組みが可能になる可能性があります。

Introduction

無細胞遺伝子発現(CFE)は、多くの用途を備えた強力なツールとして登場しました。このような用途には、疾患検出1、2、3、4、5、6、微量栄養素および小分子検出7、8、9、10、11、12、バイオマニュファクチャリング13、14、15、16、17が含まれます。 ,18, 教育19,20,21, 製造難しいタンパク質17,22,23,24,25,26,27, およびバリアントスクリーニング23,28,29,30,32 、33.これは、無細胞システムの開放性と柔軟性が与えるためです。多くの偉大なレビュー記事は、技術上の歴史的教育と将来の展望を提供しています34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44.

典型的な無細胞反応は、細胞抽出物、エネルギーミックス、および遺伝的テンプレートの3つの主要な成分で構成されています。アクティブセル抽出物には、転写と翻訳(TXTL)に必要なすべての機械が含まれ、さまざまな方法で処理することができます36.解糖性中間体、電解質、アミノ酸、およびエネルギーミックスの補因子は、TXTLプロセスをサポートします。これは、無細胞実験45における変動の主要な源であり、多くの方法で34、46を調製することができる。遺伝的テンプレートの調製は、従来のクローニング法が優れた発現特性を有するプラスミドをもたらすため、改善が少なくなっています。これらの伝統的な方法の欠点は、それらを構築し、伝播するために必要な生物学的専門知識のターンアラウンドタイムと量です。最近の最適化の取り組みにより、エネルギーミックス調製49,50と並行して行うことができる細胞抽出製剤47,48の簡単な24時間のワークフローが生まれている。ただし、従来のクローニングは CFE プロトタイピングのタイムラインに複数の日を追加します (表 1)23.市販遺伝子断片から迅速に増幅されたPCR産物は直接51を使用できますが、約5つの反応(従来の15μL量)に相当するDNAの1μgしか生成されていないため、試作実験の数が制限されます。これらの追加の循環化と等温増幅のステップにより、DNAのミリグラム量より大きい(1mgの5,000反応以上)が可能です。これは、タンパク質または組み合わせ酵素ネットワーク(無細胞代謝工学)のハイスループットスクリーニングで行うことができるテストの数を劇的に増加させます。また、高濃度DNAとして線形テンプレートライブラリを効果的に保存することができます。さらに、材料科学の用途(タンパク質ベースの繊維およびヒドロゲル)に必要な大量のタンパク質を試作するために、テンプレートの量を増やす必要があります。線形テンプレートのいくつかの制限は、BL21 DE3 Starからの抽出物を使用するか、最近発見された方法を使用して、リニアテンプレートを劣化52、53、54から保護することで克服できます。しかし、これは、PCR増幅のためのベンダー製DNAの在庫が限られているか、クローン作成に必要な生物学的専門知識と機器の問題を持つことに対処していません。

この研究は、少量のベンダー生産遺伝子断片(通常は500〜1000ngの凍結乾燥粉末)から得ることができる発現テンプレートの量を増やすために明示的に設計されたプロトコルを提示する。記載された方法は、プラスミドでの伝統的なクローニングを行ったり、生きている細胞での変換および伝播を行うために必要なスキルを必要としない。メールで遺伝子断片を受信すると、ユーザは等温転環増幅(RCA)を採用することにより、多くの無細胞反応のための十分なテンプレートを生成することができる(図1)23。ベンダーから受け取ったDNAの量は限られたスクリーニング努力に十分かもしれませんが、すぐに枯渇し、遺伝子断片の再購入には時間とコストがかかります。この方法は、特に毒性があり、大腸菌でクローンを作成することが困難な遺伝子に適しています。

Protocol

1. 遺伝子断片の設計 注:遺伝子断片は、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、開始コドン、目的遺伝子、ターミネーターを含む、転写/翻訳に必要なすべての遺伝的要素を有するべきである。ターミネータは線形式テンプレート (LET) には必要ありませんが、ユーザーが配列をプラスミドに挿入することを決定した場合は重要です。これらの配列は、T7プロモーターを使用…

Representative Results

RCAテンプレートからのsfGFPの発現は、15μL反応で0.30μLの未精製RCA DNAのみを使用した場合のpJL1プラスミドと同等であった(図2A)。実際、テンプレートの量を倍増して3倍にすることはBL21 DE3 Star抽出物では何のメリットも提供していないようで、反応あたり0.30 μLですでに飽和レベルのテンプレートを示唆しています。逆に、SHuffle株から供給される細胞抽出物に添加するとRCA…

Discussion

目的の遺伝子は任意の所望のタンパク質であり得るが、この方法の新しい採用者のためのウェルプレートリーダー上のリアルタイムまたはエンドポイント読み出しのための便利なレポーターとして蛍光タンパク質から始めることをお勧めします。新しいタンパク質配列については、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコピーし、所望のコドン最適化ツール61,62<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、このプロジェクトの部分的な支援に関するNIH 1R35GM138265-01およびNSF 2029532を認めている。

Materials

Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194
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Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).
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