투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징
Summary
관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.
Abstract
생체 내 현미경 검사 (IVM)는 단일 세포 분해능에서 세포 이동, 분열 및 사망의 시각화를 가능하게합니다. 외과적으로 삽입된 이미징 윈도우를 통한 IVM은 수일 내지 수주에 걸쳐 동일한 조직의 종방향 관찰을 허용하기 때문에 특히 강력하다. 일반적인 이미징 창은 마우스의 피부에 봉합된 생체적합성 금속 프레임의 유리 커버슬립을 포함한다. 이 창문은 생쥐의 자유로운 움직임을 방해하고 강한 염증 반응을 이끌어 낼 수 있으며 깨진 유리 또는 찢어진 봉합사로 인해 실패 할 수 있으며 그 중 어느 것도 안락사가 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 장기 복부 장기 및 유선 이미징을위한 창문은 이전에 두개골 이미징 창에 사용 된 광학적으로 투명한 실리콘 폴리머 인 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 박막으로 개발되었습니다. 이 창문은 조직에 직접 접착 할 수있어 삽입에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. PDMS는 유연하여 시간이 지남에 따라 마우스의 내구성에 기여하며 최대 35 일이 테스트되었습니다. 종방향 영상화는 개별 세션 동안 동일한 조직 영역의 영상화이다. 스테인리스 스틸 그리드가 창문 내에 내장되어 동일한 지역을 현지화하여 며칠 간격으로 동일한 위치에서 동적 프로세스 (예 : 유선의 개입)를 시각화 할 수있었습니다. 이 실리콘 창은 또한 시간이 지남에 따라 미세 전이로 발전하는 단일 전파 암 세포를 모니터링 할 수있었습니다. 이 연구에 사용 된 실리콘 창은 금속 프레임 유리 창보다 삽입하기가 간단하며 이미지 된 조직의 제한된 염증을 일으 킵니다. 또한, 임베디드 그리드는 반복 이미징 세션에서 동일한 조직 영역의 간단한 추적을 허용합니다.
Introduction
마취 된 동물의 조직 이미징 인 Intravital Microscopy (IVM)는 손상되지 않은 조직에서 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 사건의 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 적용은 매우 다양하지만 IVM은 암 생물학 분야에서 암세포가 조직을 침범하고 전이하는 방법을 밝히고 주변 미세 환경과 상호 작용하며 약물 1,2,3에 반응하는 데 도움이되었습니다. 또한, IVM은 생체외 프로파일링 접근법(예를 들어, 유세포 분석기)에 상보적인 통찰을 제공함으로써 면역 반응을 지배하는 복잡한 메카니즘의 이해를 증진시키는 열쇠가 되었다. 예를 들어, 생체 내 영상 실험은 세포 이동 및 세포 – 세포 접촉과 관련된 면역 기능에 대한 세부 사항을 밝혀 냈으며 부상이나 감염에 대한 반응으로 시공간 역학을 정량화하는 플랫폼을 제공했습니다 4,5,6,7. 이러한 과정의 대부분은 조직 학적 염색을 통해 연구 될 수도 있지만 IVM 만이 동적 변화를 추적 할 수 있습니다. 사실, 조직학적 섹션이 주어진 시간에 조직의 스냅샷을 제공하는 반면, 생체내 영상은 시간이 지남에 따라 동일한 조직 내의 세포간 및 세포내 사건을 추적할 수 있다. 특히, 형광 표지의 진행과 분자 리포터의 개발은 분자 사건이 증식, 사망, 운동성 및 다른 세포 또는 세포외 매트릭스와의 상호 작용과 같은 세포 거동과 상관되도록 허용했다. 대부분의 IVM 기술은 형광 현미경을 기반으로하며, 이는 광 산란으로 인해 더 깊은 조직을 이미징하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 관심있는 조직은 종종 종종 침습적 및 말단 절차로 외과 적으로 노출되어야합니다. 따라서, 기관 부위에 따라, 조직은 몇 내지 40h8에서 변화하는 기간 동안 연속적으로 영상화될 수 있다. 대안적으로, 영구적인 이미징 윈도우의 외과적 삽입은 7,9주까지의 기간에 걸쳐 순차적으로 동일한 조직의 영상화를 허용한다.
새로운 이미징 윈도우의 개발은 인트라바이탈 이미징 접근법(10)을 더욱 개선하기 위한 기술적 필요성으로서 강조되고 있다. 원형 생체내 영상화 창은 봉합사(11)로 피부에 고정된 유리 커버슬립을 포함하는 금속 링이다. 자유로운 움직임에 대한 간섭, 삼출물의 축적 및 유리 커버 슬립의 손상은 이러한 창문을 사용할 때 볼 수있는 일반적인 문제입니다. 또한, 프로토 타입 창은 전문적인 생산이 필요하며 외과 수술은 광범위한 교육이 필요할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 이전에 뇌(12)의 장기 이미징을 위해 두개골 창문에 사용되어온 실리콘 폴리머인 폴리디메틸실록산(PDMS)이 복부 장기 및 유선 영상화에 사용하도록 조정되었다. 여기에서, 동일한 조직 영역의 반복적인 이미징을 위한 랜드마크를 제공하기 위해 스테인리스강 그리드 주위에 윈도우를 캐스팅하는 방법을 포함하는 PDMS 기반 실리콘 윈도우를 생성하기 위한 상세한 방법이 제시된다. 또한, 복부 장기 또는 유선에 창을 삽입하기위한 간단하고 스티치가없는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 현재 사용되는 이미징 창의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 종방향 생체 내 영상의 접근성을 높입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravital 이미징 창은 시간이 지남에 따라 펼쳐지는 세포 분해능에서 생리 학적 및 병리학 적 과정을 직접 시각화하는 데 중요한 도구입니다. 마우스에 유연한 실리콘 이미징 창을 주조 및 삽입하기 위해 설명 된 새로운 절차는 현재 사용되는 이미징 창 (삼출, 파손 및 정상적인 이동성과의 간섭)의 가장 일반적인 문제 중 일부를 극복하고 마우스에 대한 추가 안전성을 제공하며이 기술의 접근성을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
레이저 컷 스테인레스 스틸 그리드를 설계하고 최적화하는 데 도움을 주신 Rob Eifert에게 감사드립니다. 이 연구는 CSHL 암 센터 (P30-CA045508)와 국립 보건원 (NIH)의 M.E. 기금 (1R01CA2374135 및 5P01CA013106-49)에 의해 지원되었습니다. CSHL 및 노스웰 헬스; 톰슨 가족 재단; 미국 전역에서 수영; Simons Foundation에서 CSHL에 대한 보조금. M.S.는 국립 일반 의료 과학 연구소 의료 과학자 교육 프로그램 교육 상 (T32-GM008444)과 NIH의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 수상 번호 1F30CA253993-01의 지원을 받았습니다. L.M.은 James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship의 지원을 받습니다. J.M.A.는 암 연구소 / 어빙턴 박사 후 펠로우십 (CRI 상 # 3435)을 수상했습니다. D.A.T.는 Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research 및 Thompson Family Foundation의 지원을 받습니다. 만화는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
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| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
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