透明なシリコーン窓による縦方向の生体内イメージング
Summary
ここでは、関心のある組織/器官および皮膚に直接接着することができる光学的に透明なシリコーン窓を使用して、長期の生体内イメージングのためのアプローチを提示する。これらの窓は、現在現場で使用されている他の窓よりも安価で汎用性が高く、外科的挿入は動物に限られた炎症および苦痛を引き起こす。
Abstract
生体内顕微鏡(IVM)は、単一細胞分解能での細胞移動、分裂、および死の可視化を可能にします。外科的に挿入されたイメージングウィンドウを通るIVMは、数日から数週間にわたって同じ組織の縦断的観察を可能にするため、特に強力である。典型的なイメージングウィンドウは、マウスの皮膚に縫合された生体適合性の金属フレーム内のガラスカバースリップで構成されています。これらの窓は、マウスの自由な動きを妨げ、強い炎症反応を誘発し、ガラスの破損または破れた縫合糸のために失敗し、そのいずれもが安楽死を必要とする可能性がある。これらの問題に対処するために、長期腹部器官および乳腺イメージング用の窓は、以前は頭蓋イメージング窓に使用されていた光学的に透明なシリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン(PDMS)の薄膜から開発された。これらの窓は組織に直接接着することができ、挿入に必要な時間を短縮する。PDMSは柔軟性があり、マウスの耐久性に寄与し、時間の経過とともに最大35日間試験されています。縦方向イメージングは、別々のセッション中に同じ組織領域をイメージングすることです。ステンレス製のグリッドが窓に埋め込まれ、同じ領域をローカライズし、数日離れた同じ場所での動的プロセス(乳腺の退縮など)の視覚化を可能にしました。このシリコーンウィンドウはまた、時間の経過とともに微小転移に発達する単一の播種性癌細胞のモニタリングを可能にした。この研究で使用されたシリコーン窓は、金属フレームのガラス窓よりも挿入が簡単で、画像化された組織の炎症を制限します。さらに、埋め込みグリッドにより、繰り返しイメージングセッションで同じ組織領域を簡単に追跡できます。
Introduction
麻酔をかけられた動物の組織のイメージングである生体内顕微鏡(IVM)は、無傷の組織における細胞分解能での生理学的および病理学的事象のダイナミクスへの洞察を提供する。この技術の応用は多岐にわたりますが、IVMはがん生物学の分野で、がん細胞が組織に侵入して転移し、周囲の微小環境と相互作用し、薬物にどのように反応するかを解明するのに役立つ1、2、3。さらに、IVMは、エクスビボプロファイリングアプローチ(例えば、フローサイトメトリー)を補完する洞察を提供することにより、免疫応答を支配する複雑なメカニズムの理解を促進するための鍵となっています。例えば、生体内イメージング実験は、細胞遊走および細胞間接触に関連する免疫機能の詳細を明らかにし、傷害または感染に応答して時空間ダイナミクスを定量するためのプラットフォームを提供している4,5,6,7。これらのプロセスの多くは、組織学的染色によっても研究することができるが、動的変化の追跡を可能にするのはIVMのみである。実際、組織学的切片は所与の時間における組織のスナップショットを提供するが、インバイタルイメージングは、同じ組織内の細胞間および細胞内事象を経時的に追跡することができる。特に、蛍光標識の進歩と分子レポーターの発達により、分子事象は、増殖、死、運動性、および他の細胞または細胞外マトリックスとの相互作用などの細胞挙動と相関することが可能になった。ほとんどのIVM技術は蛍光顕微鏡法に基づいており、光散乱のためにより深い組織のイメージングを困難にします。したがって、関心のある組織は、しばしば侵襲的および終末的処置で外科的に曝露される必要がある。したがって、器官部位に応じて、組織を、数時間から40時間8まで変化する期間にわたって連続的に画像化することができる。あるいは、永久的な画像化窓の外科的挿入は、7、9週までの数日にわたって同じ組織の画像化を順次可能にする。
新しいイメージングウィンドウの開発は、バイタル内イメージングアプローチをさらに改善するための技術的必要性として強調されています10。プロトタイプのインタビタル画像化ウィンドウは、縫合糸11で皮膚に固定されたガラスカバースリップを含む金属リングである。自由な動きへの干渉、滲出液の蓄積、およびガラスカバースリップの損傷は、そのような窓の使用で見られる一般的な問題である。さらに、プロトタイプウィンドウは特殊な生産を必要とし、外科的処置は広範なトレーニングを必要とする可能性がある。これらの問題に対処するために、シリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン(PDMS)は、以前は脳12における長期画像化のための頭蓋窓において使用されていたが、腹部器官および乳腺画像化における使用のために適合された。ここでは、PDMSベースのシリコーン窓を生成するための詳細な方法が提示され、同じ組織領域の反復画像化のためのランドマークを提供するためにステンレス鋼グリッドの周りに窓を鋳造する方法を含む。さらに、腹部器官または乳腺の上に窓を挿入するための簡単でステッチフリーの外科的処置が記載されている。この新しいアプローチは、現在使用されているイメージングウィンドウの最も一般的な問題のいくつかを克服し、縦方向のインタビタルイメージングのアクセシビリティを向上させます。
Protocol
Representative Results
Discussion
生体内イメージングウィンドウは、生理学的および病理学的プロセスを細胞分解能で直接視覚化するための重要なツールです。マウスに柔軟なシリコーンイメージングウィンドウをキャスティングおよび挿入するために説明されている新しい手順は、現在使用されているイメージングウィンドウの最も一般的な問題(滲出液、破損、および通常の可動性との干渉)のいくつかを克服し、マウス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
レーザーカットされたステンレス鋼グリッドの設計と最適化におけるロブ・アイファートの支援に感謝します。この研究は、CSHLがんセンター(P30-CA045508)および国立衛生研究所(NIH)からのM.E.のための資金(1R01CA2374135および5P01CA013106-49)によって支援された。CSHLとノースウェルヘルス;トンプソン家族財団;アメリカ全土を泳ぐ。サイモンズ財団からCSHLへの助成金。M.S.は、一般医科学研究所医学者養成プログラム研修賞(T32-GM008444)およびNIH国立がん研究所(受賞番号1F30CA253993-01)の支援を受けました。L.M.はジェームズ・S・マクドネル財団のポスドク・フェローシップの支援を受けています。J.M.A.は、がん研究所/アービントン・ポスドク・フェローシップ(CRI賞#3435)の受賞者です。D.A.T.は、Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer ResearchとThompson Family Foundationの支援を受けています。漫画は Biorender.com で作成されました。
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
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