Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs) são utilizadas em diferentes estudos para comprovar seu potencial como tratamento livre de células devido à sua carga derivada de sua fonte celular, como o lisato plaqueta (PL). Quando usados como tratamento, espera-se que os EVs entrem nas células-alvo e afetuem uma resposta a partir delas. Nesta pesquisa, os EVs derivados do PL têm sido estudados como um tratamento livre de células para osteoartrite (OA). Assim, foi criado um método para rotular EVs e testar sua absorção em explants de cartilagem. Os EVs derivados do PL são rotulados com o corante lipofílico PKH26, lavados duas vezes através de uma coluna e, em seguida, testados em um modelo OA in vitro orientado para inflamação por 5 h após quantificação de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). De hora em hora, as explantas de cartilagem são fixas, parafinadas, cortadas em seções de 6 μm para montar em lâminas, e observadas sob um microscópio confocal. Isso permite verificar se os EVs entram nas células-alvo (condrócitos) durante esse período e analisam seu efeito direto.
Introduction
A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular que implica uma inflamação progressiva e irreversível e destruição da matriz extracelular da cartilagem articular1. Embora várias formas de artrite tenham inúmeros tratamentos2,3,4, estes são restritos por seus efeitos colaterais e eficácia limitada. Técnicas de engenharia de tecidos utilizando implantação de condrocito autólogo são rotineiramente aplicadas para o tratamento regenerativo da cartilagem lesionada nas lesões precoces da cartilagem OA4. As terapias baseadas em células são restritas principalmente devido ao número limitado de condrócitos fenotipicamente estáveis ou chondroprogenitors capazes de reparar efetivamente a cartilagem3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir a progressão da doença e regenerar grandes lesões de cartilagem é de suma importância.
Vesículos extracelulares (EVs) têm sido sugeridos como um tratamento para OA por diferentes autores5,6. Os EVs são corpos membranous secretados pela maioria dos tipos de células, estão envolvidos na sinalização intercelular, e têm sido mostrados para exercer os efeitos terapêuticos das células-tronco7,8,9, devido ao qual recentemente despertaram interesse em medicina regenerativa10. Os EVs derivados de células estromais mesenquimais (MSCs) são os principais EVs terapêuticos investigados para OA, embora outras células relacionadas à articulação tenham sido usadas como fontes de EV, por exemplo, condroprogenitors ou células imunes11,12.
Concentrados plaquetas, como plaquetas plaquetas (PLs), são usados para melhorar a cicatrização de feridas em diferentes lesões, como úlceras córneas13,14,15 ou na regeneração do tecido tendinoso16,devido à hipótese de que o componente EV dos concentrados plaquetas pode ser responsável por esses efeitos17 . Alguns estudos relacionados a doenças relacionadas à articulação utilizam EVs derivados de plaquetas (PL-EVs) como tratamento para amenizar as condições osteoartríticas. Os PL-EVs melhoram a proliferação de condrocitos e a migração celular ativando a via Wnt/β-catenin18, promovendo a expressão de marcadores condrogênicos em condrócitos osteoartréticos19, ou mostrando níveis mais elevados de proteínas condrogênicas e menos anormalidades tissulares em coelhos osteoartrrápticos tratados com PL-EVs18.
Os EVs contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos que são liberados para a célula-alvo, estabelecendo a comunicação célula-célula, que é a principal característica relacionada às suas aplicações terapêuticas20. Os efeitos dos EVs dependem de suas células de alcance e posterior liberação de carga. Esse efeito pode ser confirmado indiretamente por alterações causadas nas células, como atividade metabólica ou modificação da expressão genética. No entanto, esses métodos não permitem a visualização de como os EVs chegam às células para exercer sua função. Assim, este artigo apresenta um método para rotular esses EVs derivados de PL para serem utilizados como tratamento para explantas de cartilagem OA orientadas por inflamação. A microscopia confocal foi utilizada para monitorar a absorção e progressão de EV para os condrócitos presentes nas explantas em um lapso de tempo de 5h.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imagem EV ajuda a entender as propriedades de EV, como seus mecanismos de liberação e absorção. Sua imagem permite o monitoramento de sua biodistribução e a caracterização de suas propriedades farmacocinéticas como veículos de drogas. No entanto, a imagem e o rastreamento de EV podem ser difíceis devido aos seus pequenos tamanhos, embora muitos dispositivos de imagem e técnicas de rotulagem tenham sido desenvolvidos para ajudar os pesquisadores a monitorar EVs sob condições in vitro e in vivo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, co-financiado pelo Fundo Social Europeu da ESF e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do ERDF (MS16/00124; CP16/00124); pelo PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares; pelo Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); pelo programa de pós-doutorado FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro do FUTURMed, financiado em 50% pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares e em 50% pela ESF; e pelo Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
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