Здесь мы представляем протокол для маркировки внеклеточных везикул, полученных из лизата тромбоцитов, для мониторинга их миграции и поглощения в хрящевых эксплантатах, используемых в качестве модели остеоартрита.
Внеклеточные везикулы (EV) используются в различных исследованиях, чтобы доказать их потенциал в качестве бесклеточного лечения из-за их груза, полученного из их клеточного источника, такого как лизат тромбоцитов (PL). При использовании в качестве лечения ожидается, что EV попадут в клетки-мишени и вызовут ответ от них. В этом исследовании PL-производные EV были изучены как бесклеточное лечение остеоартрита (ОА). Таким образом, был создан метод маркировки электромобилей и проверки их поглощения на хрящевых эксплантатах. PL-производные EV маркируются липофильным красителем PKH26, дважды промывают через столбец, а затем тестируют в модели ОА in vitro, управляемой воспалением, в течение 5 ч после количественной оценки частиц анализом отслеживания наночастиц (NTA). Ежечасно экспланты хряща фиксируют, парафинируют, разрезают на участки по 6 мкм для крепления на слайдах и наблюдают под конфокальным микроскопом. Это позволяет проверить, попадают ли EV в клетки-мишени (хондроциты) в этот период и проанализировать их прямое действие.
Остеоартроз (ОА) – суставное дегенеративное заболевание, подразумевающее прогрессирующее и необратимое воспаление и разрушение внеклеточного матрикса суставногохряща1. Хотя различные формы артрита имеют многочисленные методылечения 2,3,4,они ограничены своими побочными эффектами и ограниченной эффективностью. Методы тканевой инженерии с использованием аутологичной имплантации хондроцитов обычно применяются для регенеративного лечения поврежденного хряща при ранних поражениях хрящаОА4. Клеточная терапия ограничена в основном из-за ограниченного количества фенотипически стабильных хондроцитов или хондропрогениторов, способных эффективно восстанавливать хрящ3. Поэтому разработка новых терапевтических стратегий для предотвращения прогрессирования заболевания и регенерации крупных поражений хряща имеет первостепенное значение.
Внеклеточные везикулы (EV) были предложены в качестве лечения ОА разными авторами5,6. EV представляют собой мембранные тела, секретируемые большинством типов клеток, участвуют в межклеточной сигнализации и, как было показано, оказывают терапевтическое воздействие стволовых клеток7,8,9,из-за чего они недавно вызвали интерес к регенеративной медицине10. EV, полученные из мезенхимальных стромальных клеток (МСК), являются основными терапевтическими EV, исследуемыми для ОА, хотя другие связанные с суставами клетки использовались в качестве источников EV, например, хондропрогениторы или иммунные клетки11,12.
Концентраты тромбоцитов, такие как лизаты тромбоцитов (PL), используются для улучшения заживления ран при различных травмах, таких как язвы роговицы13,14,15 или при регенерации ткани сухожилия16,из-за гипотезы о том, что компонент EV концентратов тромбоцитов может быть ответственен за эти эффекты17 . Некоторые исследования, связанные с заболеваниями, связанными с суставами, используют тромбоцитарные EV (PL-EV) в качестве лечения для улучшения остеоартритных состояний. PL-EV улучшают пролиферацию хондроцитов и миграцию клеток, активируя Wnt/β-катениновыйпуть 18,способствуя экспрессии хондрогенных маркеров в остеоартритных хондроцитах19или показывая более высокие уровни хондрогенных белков и меньшее количество тиссулярных аномалий у остеоартритных кроликов, получавших PL-EV18.
EV содержат белки, липиды и нуклеиновые кислоты, которые высвобождаются в клетку-мишень, устанавливая межклеточную связь, что является основной особенностью, связанной с их терапевтическим применением20. Эффекты электромобилей зависят от их достижения клеток и последующего высвобождения груза. Этот эффект может быть косвенно подтвержден изменениями, вызванными в клетках, такими как метаболическая активность или модификация экспрессии генов. Однако эти методы не позволяют визуализировать то, как электромобили достигают клеток, чтобы выполнять свою функцию. Таким образом, в этой статье представлен метод маркировки этих PL-производных EV для использования в качестве лечения эксплантов хряща ОА, вызванных воспалением. Конфокальная микроскопия использовалась для мониторинга поглощения и прогрессирования EV к хондроцитам, присутствующим в эксплантатах, в течение 5 ч.
Визуализация EV помогает понять свойства EV, такие как механизмы их высвобождения и поглощения. Их визуализация позволяет контролировать их биораспределение и характеризовать их фармакокинетические свойства как лекарственные средства. Тем не менее, визуализация и отслеживание электр?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось Институтом спасения Карлоса III, Министерством экономики и конкуренции, совместно финансируемым Европейским социальным фондом ESF и Европейским фондом регионального развития ERDF (MS16/00124; СР16/00124); ПРОГРАММОЙ JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), финансируемой за счет налога на устойчивый туризм Балеарских островов; Генеральным директором по расследованиям, Консультативным советом по расследованию, Управляющим Балеаром (FPI/2046/2017); постдокторской программой FOLIUM (FOLIUM 17/01) в рамках FUTURMed, финансируемой под 50% за счет налога на устойчивый туризм Балеарских островов и под 50% от ESF; и Комитетом по расследованию и расследованию Банковского фонда санга и безопасности Балеарских болезней (CDI21/03).
Material | |||
1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
Equipment | |||
Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |