Merking av ekstracellulære vesicles for overvåking av migrasjon og opptak i bruskutløp

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å merke blodplater lysate-avledede ekstracellulære vesikler for å overvåke deres migrasjon og opptak i bruskutløp som brukes som modell for slitasjegikt.

Abstract

Ekstracellulære vesicles (ELBILER) brukes i forskjellige studier for å bevise sitt potensial som en cellefri behandling på grunn av deres last avledet fra deres cellulære kilde, for eksempel blodplatelysat (PL). Når elbiler brukes som behandling, forventes det at de kommer inn i målcellene og påvirker et svar fra disse. I denne forskningen har PL-avledede elbiler blitt studert som en cellefri behandling for slitasjegikt (OA). Dermed ble det satt opp en metode for å merke elbiler og teste opptaket på bruskutløp. PL-avledede elbiler er merket med det lipofile fargestoffet PKH26, vaskes to ganger gjennom en kolonne, og testes deretter i en in vitro-betennelsesdrevet OA-modell i 5 timer etter partikkel kvantifisering ved nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). Hver time er bruskutløp faste, paraffinerte, kuttet i 6 μm seksjoner for å montere på lysbilder, og observeres under et konfokalt mikroskop. Dette gjør det mulig å verifisere om elbiler kommer inn i målcellene (kondrocytter) i denne perioden og analyserer deres direkte effekt.

Introduction

Artikulær degenerativ sykdom som innebærer en progressiv og irreversibel betennelse og ødeleggelse av den ekstracellulære matrisen til leddbrusk¹. Selv om ulike former for leddgikt har mange behandlinger^2,3,4, disse er begrenset av deres bivirkninger og begrenset effekt. Vevsteknikksteknikker ved hjelp av autolog kondrocyttimplantasjon brukes rutinemessig til regenerativ behandling av skadet brusk i tidlig OA brusk lesjoner⁴. Cellebaserte terapier er begrenset hovedsakelig på grunn av det begrensede antallet fenotypisk stabile kondrocytter eller kondroprogenitorer som er i stand til effektivt å reparere brusk³. Derfor er utviklingen av nye terapeutiske strategier for å forhindre sykdomsprogresjon og regenerere store bruskskader av avgjørende betydning.

Ekstracellulære vesicles (ELBILER) har blitt foreslått som en behandling for OA av forskjellige forfattere^5,6. Elbiler er membranøse organer utskilt av de fleste celletyper, er involvert i intercellulær signalering, og har vist seg å utøve stamcellers terapeutiske effekter^7,8,9, som de nylig har fremkalt interesse for regenerativ medisin¹⁰. ELBILER avledet fra mesenchymale stromale celler (MSCer) er de viktigste terapeutiske ELBIL-ene som undersøkes for OA, selv om andre leddrelaterte celler har blitt brukt som EV-kilder, for eksempel kondroprogenitorer eller immunceller^11,12.

Blodplatekonsentrater, som blodplatelysater (PLs), brukes til å forbedre sårheling i forskjellige skader, for eksempel hornhinnensår^13,14,15 eller i regenerering av senervev¹⁶, på grunn av hypotesen om at EV-komponenten av blodplatekonsentrater kan være ansvarlig for disse effektene¹⁷ . Noen studier relatert til leddrelaterte sykdommer bruker blodplaterette-avledede elbiler (PL-elbiler) som behandling for å forbedre osteoarthritiske tilstander. PL-ELBILER forbedrer kondrocyttproliferasjon og cellemigrasjon ved å aktivere Wnt / β-catenin-banen¹⁸, fremme uttrykket av kondrogene markører i osteoarthritic kondrocytter¹⁹, eller vise høyere nivåer av kondrogene proteiner og færre tissulære abnormiteter hos osteoarthritic kaniner behandlet med PL-EVs¹⁸.

Elbiler inneholder proteiner, lipider og nukleinsyrer som frigjøres til målcellen, og etablerer celle-til-celle-kommunikasjon, som er hovedfunksjonen relatert til deres terapeutiske applikasjoner²⁰. Effektene av elbiler avhenger av deres rekkeviddeceller og påfølgende lastfrigjøring. Denne effekten kan bekreftes indirekte av endringer forårsaket i celler, for eksempel metabolsk aktivitet eller genuttrykksmodifisering. Disse metodene tillater imidlertid ikke visualisering av hvordan elbiler når celler for å utøve sin funksjon. Dermed presenterer dette papiret en metode for å merke disse PL-avledede ELBIL-ene som skal brukes som behandling for betennelsesdrevne OA-bruskutløp. Konfokal mikroskopi ble brukt til å overvåke EV-opptak og progresjon til kondrocyttene som er tilstede i eksplantene i et tidsforløp på 5 timer.

Protocol

MERK: Bruskutløp ble hentet fra IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) i samsvar med institusjonelle retningslinjer etter etisk godkjenning av prosjektet av CEI-IB (IB 3656118 PI). 1. Kolonne forberedelse Likevektskolonner etter produsentens instruksjoner eller som følger: Fjern kolonnehetten og likevekt kolonnen. Fjern lagringsbufferen ved elution. Vask kolonnen 3 ganger med 2,5 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Under hver vask, vent til kolonnen absorberer hele volumet….

Representative Results

En skjematisk oversikt over EV-merking og opptaksovervåking vises i figur 1. Partikkelkonsentrasjonen og EV-størrelsen som NTA har oppdaget i tabell 1, viser at EV-konsentrasjonen reduseres under prosessen på grunn av rensetrinnet som utføres to ganger etter merking med kolonnen. Mengden oppnådd er imidlertid i det optimale spekteret av antall partikler som skal brukes til behandling. Denne partikkelkonsentrasjonen brukes til å beregne volumet av PKH-PL-EV og kontroll …

Discussion

EV-avbildning bidrar til å forstå EV-egenskaper, for eksempel frigjørings- og opptaksmekanismer. Deres bildebehandling tillater overvåking av deres biodistribusjon og karakterisering av deres farmakokinetiske egenskaper som narkotikakjøretøy. Imidlertid kan EV-bildebehandling og sporing være vanskelig på grunn av deres små størrelser, selv om mange bildeenheter og merkingsteknikker er utviklet for å hjelpe forskere med å overvåke ELBILER under in vitro- og in vivo-forhold ^…

Materials

Material
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak	BD	303174
2-Propanol (Isopropanol)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants	IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks	IdISBa Biobank		Fee for service
Exo-spin mini-HD columns	Cell guidance systems	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatin M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Biowest	L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNFα	R&D systems	210-TA-005	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome	Thermo Scientific™	A78100101
TCS-SPE confocal microscope	Leica Microsystems	5200000271