エキノコッカス顆粒症のストロビレー化形態の一過性形質導入
1Student Research Committee, School of Medicine,Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran,Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine,Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine,Jilin University
Summary
我々は、第3世代レンチウイルスベクターを用いた エキノコッカス顆粒症 のさまざまな発生段階における迅速な一過性形質導入技術について記載する。
Abstract
嚢胞性エキノコックス症または包虫症は、犬の腸内に生息する小さなサナダムシである エキノコッカス・グラニュローサス によって引き起こされる最も重要な人獣共通感染症の1つである。病因や疾患の制御・予防のメカニズムを理解するための応用遺伝学的研究が急務です。しかし、効果的な遺伝子評価システムの欠如は、 エキノコッカス 種を含むセストード寄生虫の機能遺伝学の直接的な解釈を妨げる。本研究は、 顆粒菌のメタセストードおよびストロビレーテッド形態におけるレンチウイルス遺伝子一過性形質導入の可能性を実証する。プロトスコレース(PSC)を胞状嚢胞から単離し、特定の二相性培養培地に移してストロビレー化ワームに発達させた。ワームを、形質導入プロセス制御としてHEK293T細胞と共に回収した第3世代レンチウイルスでトランスフェクトした。ストロビレーテッドワームにおいて24時間および48時間にわたって顕著な蛍光が検出され、 E. granulosusにおける一過性のレンチウイルス形質導入を示した。この研究は、サナダムシにおけるレンチウイルスベースの一過性形質導入の最初の試みを提示し、扁平虫生物学に関する実験的研究における潜在的な意味合いを持つ有望な結果を示す。
Introduction
嚢胞性エキノコックス症(CE)は、テニイ科1,2科内の小さなサナダムシであるエキノコッカス・グラニュローサスによって引き起こされる最も重要な蠕虫疾患の1つである。顆粒菌の免疫診断およびワクチン開発に関する広範な研究が行われている。しかし、寄生虫生物学の分子基盤に関する不十分な知識は、包虫症の診断、管理、予防に大きな限界をもたらす3,4,5,6。
近年、ゲノムシーケンシングおよびトランスクリプトーム法の開発により、いくつかの研究グループ7、8、9によって扁平虫に関する幅広い分子研究が行われている。しかしながら、寄生虫の世界では、寄生性扁平虫における遺伝子導入技術の進歩は、一部の原生動物に対して開発された再現性の高い一過性形質導入法と比較して依然として限られている10、11、12。
ウイルス送達システムの使用は、過去20年間にわたり、導入遺伝子送達および遺伝子/タンパク質調査のための不可欠なツールとして浮上してきました13。レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し、したがって、有糸分裂後細胞に感染することを可能にする14、15、16。最近の証拠は、哺乳類細胞にレンチウイルスベースの形質導入システムを使用することで、以前のノックイン/ノックダウン技術の限界のほとんどを克服する可能性を提供することを示しています。GFP発現などの適切な分子マーカーを有する発現レンチウイルスベクターの設計および構築については、以前に16に記載されている。そこで、我々は、顆粒菌のプロトスコレースおよびストロビレーテッドワームにおけるGFPレポーター遺伝子のレンチウイルス一過性形質導入を評価する。
Protocol
本研究は、国立研究開発法人医薬研究開発機構および研究倫理審査委員会第958680号により承認されました。レンチウイルスはBSL-2生物として分類される。したがって、このプロトコルのすべての実験室培養手順は、滅菌実験室の実践を使用して実施され、NIHガイドラインに従って層流フードの下で実施された。 図1は 、異なる 顆粒菌 ステージに対する研究プロト…
Representative Results
ここでは、第3世代レンチウイルスベクターを用いた顆粒菌における迅速かつ効率的な一過性形質導入技術について説明する。我々は、以前に25、26に記載されるように、ストロビレーションされたワームを得るために、二相性培養培地中でPSCsを培養した。プロトスコレックは、インビトロで6週間後にストロビレーテッドワームに発達?…
Discussion
線虫とプラチヘルミンテス生物学の分子基盤を理解することは、人獣共通感染症の寄生虫の病原性を理解するために不可欠です27。効果的な遺伝子評価システムの欠如は、エキノコッカス種12,27を含むセストード寄生虫の機能遺伝学の直接的な解釈に対する大きな障害である。本研究は、E. Granulousの一過性形質導入に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この出版物で報告された研究は、イランのテヘランにある国立医療研究開発研究所(NIMAD)の賞番号958680の下でエリート研究者助成金委員会によって支援されました。
Materials
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
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Cite This Article
Mohammadi, M. A., Afgar, A., Faridi, A., Mousavi, S. M., Derakhshani, A., Borhani, M., Fasihi Harandi, M. Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus. J. Vis. Exp. (187), e62783, doi:10.3791/62783 (2022).