Trasduzione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus
Summary
Descriviamo una tecnica di trasduzione rapida transitoria in diversi stadi di sviluppo di Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione.
Abstract
L’echinococcosi cistica o malattia idatide è una delle più importanti malattie parassitarie zoonotiche causate da Echinococcus granulosus, una piccola tenia ospitata nell’intestino dei canini. C’è un urgente bisogno di ricerca genetica applicata per comprendere i meccanismi di patogenesi e controllo e prevenzione delle malattie. Tuttavia, la mancanza di un efficace sistema di valutazione genica impedisce l’interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, compresa la specie Echinococcus . Il presente studio dimostra il potenziale della trasduzione transitoria del gene lentivirale nelle forme metacestolodiche e strobilate di E. granulosus. I protoscoleces (PSC) sono stati isolati dalle cisti idatide e trasferiti in specifici terreni di coltura bifasici per svilupparsi in vermi strobilati. I vermi sono stati trasfettati con lentivirus di terza generazione raccolti, insieme a cellule HEK293T come controllo del processo di trasduzione. Una fluorescenza pronunciata è stata rilevata nei vermi strobilati per 24 ore e 48 ore, indicando una trasduzione lentivirale transitoria in E. granulosus. Questo lavoro presenta il primo tentativo di trasduzione transitoria basata sul lentivirus nelle tenie e dimostra i risultati promettenti con potenziali implicazioni negli studi sperimentali sulla biologia dei vermi piatti.
Introduction
L’echinococcosi cistica (CE) è una delle più importanti malattie da elminti causata da Echinococcus granulosus, una piccola tenia della famiglia Taeniidae 1,2. Sono stati condotti studi approfonditi sullo sviluppo immunodiagnostico e vaccinale per E. granulosus. Tuttavia, una conoscenza inadeguata delle basi molecolari della biologia dei parassiti pone importanti limitazioni nella diagnosi, gestione e prevenzione della malattia idatide 3,4,5,6.
Negli ultimi anni, a causa dello sviluppo del sequenziamento del genoma e dei metodi trascrittomici, una vasta gamma di studi molecolari è stata condotta sui platelminti da diversi gruppi di ricerca 7,8,9. Tuttavia, nel mondo dei parassiti, i progressi nella tecnologia di trasferimento genico nei vermi piatti parassiti sono ancora limitati rispetto ai metodi di trasduzione transitoria altamente riproducibili sviluppati per alcuni protozoi 10,11,12.
L’uso di sistemi di consegna virale è emerso come uno strumento essenziale per la consegna transgenica e le indagini geniche / proteiche negli ultimi due decenni13. Il lentivirus infetta sia le cellule in divisione che quelle non in divisione, rendendo così possibile infettare le cellule postmitotiche 14,15,16. Prove recenti indicano che l’utilizzo di un sistema di trasduzione basato su lentivirus nelle cellule di mammifero offre il potenziale per superare la maggior parte dei limiti delle precedenti tecniche di knock-in / knock-down. La progettazione e la costruzione di vettori lentivirali di espressione con marcatori molecolari appropriati, come l’espressione GFP, sono stati descritti in precedenza16. Pertanto, valutiamo la trasduzione transitoria lentivirale di un gene reporter GFP nei protoscoleces e nei vermi strobilati di E. granulosus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendere le basi molecolari dei nematodi e la biologia di Platyhelminthes è fondamentale per comprendere la patogenicità dei parassiti zoonotici27. La mancanza di un efficace sistema di valutazione genica è un grosso ostacolo all’interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, tra cui la specie Echinococcus 12,27. Il presente studio dimostra l’eccellente potenziale del lentivirus nella trasduzion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall’Elite Researcher Grant Committee con il numero di premio 958680 del National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.
Materials
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
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