電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング
Summary
このプロトコルは、事前埋め込みEdU-ストレプトアビジン-ナノゴールド標識とChromEMTの組み合わせを採用した、構造的に保存されたクロマチンin in situにおける 複製部位の高解像度マッピングのための技術を提示する。
Abstract
細胞核におけるDNAフォールディングの原理と、基本的な遺伝子機能(転写、複製、分離など)の充足中に起こるその動的形質転換は、構造的に保存された核における特定のクロマチン遺伝子座の高分解能可視化に対する実験的アプローチの欠如のために、ほとんど理解されていないままである。ここでは、新たに合成されたDNAのEdU標識と、その後の標識検出とナノ金粒子のAg増幅、クロマチンのChromEM染色を組み合わせることにより、単層細胞培養における複製ドメインを その場で可視化するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、室温サンプル処理のためのクロマチンの最良の構造保存を提供する従来のグルタルアルデヒド固定と互換性のある、高コントラスト、高効率の埋め込み前標識を可能にします。事前埋め込み標識の別の利点は、切片化のために目的の細胞を予め選択する可能性である。これは、不均一な細胞集団の分析、ならびに複製部位におけるクロマチン組織の高分解能3D分析に対する電子断層撮影アプローチとの適合性、および複製後のクロマチン再配列および相間における姉妹染色分体偏析の分析にとって特に重要である。
Introduction
DNA複製は、細胞分裂中の遺伝情報の忠実なコピーと伝達に必要な基本的な生物学的プロセスです。高等真核生物では、DNA複製は厳しい時空間調節を受け、これは複製起点1の逐次活性化に現れる。同期的に起動する隣接するレプリケーション オリジンは、レプリコン2 のクラスターを形成します。光学顕微鏡のレベルでは、進行中のDNA複製の部位は、様々な数およびサイズの複製病巣として検出される。複製病巣は、標識されたDNA 3,4の複製タイミングに応じて細胞核内の空間分布の特定のパターンを示し、これは次に、その遺伝子活性と密接に相関している。空間と時間で厳密に順序付けられた明確に定義されたDNA複製配列のおかげで、複製標識は、複製プロセス自体の研究だけでなく、定義された転写活性および圧縮レベルを有する特定のDNAサブフラクションを区別するためにも、正確なDNA標識の強力な方法である。複製クロマチンの可視化は、通常、DNA複製機構の主要タンパク質成分の検出(免疫染色または蛍光タンパク質タグ5,6の発現による)または修飾DNA合成前駆体の組み込みによって行われる7,8,9,10 .これらのうち、新しく複製されたDNAへの改変ヌクレオチドの組み込みに基づく方法のみが、複製中のクロマチンの立体構造変化の捕捉を可能にし、複製完了後の複製ドメインの挙動を追跡する。
高等真核生物では、クロマチンへのDNAパッケージングは、基本的な遺伝的機能(転写、複製、修復など)の調節にさらなるレベルの複雑さを加える。クロマチンフォールディングは、鋳型合成に必要な調節トランスファクターおよびDNA立体構造変化(二重らせん巻き戻し)に対するDNAのアクセス可能性に影響します。したがって、細胞核におけるDNA依存性の合成プロセスには、クロマチンの凝縮した抑制状態から、よりアクセスしやすく、開いた立体構造への構造遷移が必要であることが一般に受け入れられている。細胞学的には、これら2つのクロマチン状態は、ヘテロクロマチンおよびユークロマチンとして定義される。しかし、核内でDNAが折り畳まれる様式については、まだコンセンサスがない。この仮説は、ヌクレオソーム繊維が相分離機構によって充填密度が制御されるランダムなポリマーとして振る舞う「ポリマー溶融」モデル11から、厚さの増加12、13のクロマチン繊維様構造の逐次形成を仮定する階層折り畳みモデルまで及ぶ。階層フォールディングモデルは最近、in situDNA−DNA接触(染色体立体構造キャプチャ、3C)の解析に基づく分子アプローチから支持を得て、クロマチン構造ドメインの階層の存在を実証した14。複製単位は、これらのクロマチンドメイン15と非常によく相関していることに注意することが重要です。これらのモデルの主な批判は、細胞膜の透過処理や非クロマチン成分の除去などのサンプル調製手順によって引き起こされる潜在的な人工クロマチン凝集に基づいており、超構造研究のためのクロマチンコントラストを改善しながら、様々なプローブ(例えば、抗体)のクロマチンアクセシビリティを改善する。DNA結合性フルオロフォア媒介のジアミノベンジジン(ChromEMT6)の光酸化による電子顕微鏡検査のための選択的DNA染色における最近の技術的進歩は、この障害の排除を可能にした。しかし、複製DNAの電子顕微鏡可視化についても同じ考察が成り立つ17,18.ここでは、インタクトなアルデヒド架橋細胞において、新たに合成されたDNAとトータルクロマチンの同時高分解能超微細構造マッピングを可能にする技術について説明します。この技術は、クリックケミストリーによるEdU標識DNAの検出と、ビオチン化プローブ、ストレプトアビジン-ナノゴールド、およびChromEMTを組み合わせたものです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法には、以前に公開されたプロトコルに比べていくつかの利点があります。第一に、複製されたDNAを標識するためにClick-chemistryを使用することで、抗体によるBrdU検出のためのDNA変性の前提条件の必要性が排除され、クロマチンの超構造をよりよく保存できます。
第二に、グルタルアルデヒド固定および結合していないアルデヒド基の適切なクエンチ後…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、RSF (助成金 #17-15-01290) と RFBR (助成金 #19-015-00273) によって部分的にサポートされました。著者らは、ロモノーソフ・モスクワ州立大学開発プログラム(PNR 5.13)とベロゼルスキー物理化学生物学研究所の相関イメージングにおけるニコン・センター・オブ・エクセレンスに、イメージング機器へのアクセスに感謝している。
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
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