Summary
Denne protokol er blevet etableret for at dyrke tetrahydrobiopterin (BH4) - og inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) - mangelfulde primære murine makrofager til at studere NO-redox biologi. Undersøgelsen fokuserer på at reducere potentiel forurening af BH4 og andre artefakter, der findes i traditionelle isolations- og kulturmetoder, som kan forvirre eksperimentelle resultater og fortolkning af resultater.
Abstract
Makrofager er afledt af hæmatopoietiske stamceller i hele kroppen, er centrale for inflammatoriske processer og deltager i medfødte og adaptive immunresponser. In vitro-undersøgelse af makrofager kan udføres ved ex vivo-dyrkning fra bughinden eller gennem differentiering af myeloide knoglemarvsstamceller til dannelse af knoglemarvsafledte makrofager (BMDM'er). En fælles tilgang til makrofagdifferentiering fra prækursorer indebærer anvendelse af konditionerede medier fra L929-celler (LCM). Dette medie er let at selvproducere, men lider af batchvariabilitet, og dets bestanddele er udefinerede. På samme måde bruges Foetal Bovine Serum (FBS) til at understøtte vækst, men indeholder en stor blanding af udefinerede molekyler, der kan variere mellem batches. Disse metoder er ikke tilstrækkelige til undersøgelse af nitrogenoxidbiologi og redoxmekanismer, da de begge indeholder betydelige mængder små molekyler, der enten forstyrrer redoxmekanismer eller supplerer niveauer af cofaktorer, såsom tetrahydrobiopterin (BH4), der kræves til fremstilling af NO fra inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS). I denne rapport præsenterer vi en optimeret protokol, der muliggør kontrol af NO-redox-miljøet ved at reducere niveauerne af eksogent biopterin, samtidig med at der opretholdes betingelser, der er egnede til cellevækst og differentiering. Stram kontrol af kulturmediesammensætning hjælper med at sikre eksperimentel reproducerbarhed og letter nøjagtig fortolkning af resultaterne. I denne protokol blev BMDM'er opnået fra en GTP-cyclohydrolase (GCH)-mangelfuld musemodel. Dyrkning af BMDM'er blev udført med medier, der indeholdt enten (i) konditioneret LCM eller (ii) rekombinant M-CSF og GM-CSF for at producere minimale artefakter, samtidig med at BH4 og NO-mangelfulde dyrkningsbetingelser blev opnået - hvilket muliggør reproducerbar undersøgelse af NO-redoxbiologi og immunmetabolisme in vitro.
Introduction
Makrofager er blevet etableret som en interessant celletype i en lang række sygdomme og tilstande, mange tilsyneladende ikke relateret til deres traditionelle fokus på medfødt immunitet. Da makrofagfysiologi er stærkt afhængig af det væv eller miljø, de er bosiddende i, er der opstået mange metoder og modeller til at studere deres funktion og de forskellige veje, der er involveret. Historisk set dominerede makrofagcellelinjer, såsom RAW264.7, feltet, men disse er gradvist blevet erstattet til fordel for forskellige primære cellemodeller. For eksempel kan murine makrofager isoleres fra peritoneal skylning efter behandling med thioglycolate. Samtidig med at de giver en nyttig model til undersøgelse af vævsresidente celler, har disse peritoneale makrofager vist sig at demonstrere et mere afdæmpet respons på forskellige eksterne stimuli og derved begrænse deres egnethed til mange downstream-applikationer1.
Som et alternativ har knoglemarvsafledte makrofager (BMDM'er), der stammer fra myeloide stamceller i knoglemarven, vist sig som en værdifuld model til at studere forskellige aspekter af makrofagbiologi, herunder modning og de forskellige klassiske fænotyper forbundet med makrofager, M0 (naiv, ikke-aktiveret), M1 (proinflammatorisk, normalt aktiveret med LPS / IFN) og M2 (pro-opløsning, normalt aktiveret med IL-4)2, 3. Differentieringen af myeloide stamceller i BMDM'er er imidlertid afhængig af tilstedeværelsen af makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) i kulturmediet 4,5. Dette kan leveres enten i form af oprenset protein tilsat mediet eller fra L929-konditionerede medier (LCM). Fordelene ved at bruge BMDM'er (omkostninger og effektivitet) skal afvejes mod de begrænsninger, som deres følsomhed over for forskellige stimuli (cytokiner, metaboliske mellemprodukter og RNS / ROS) giver.
Tidligere data tyder på, at indholdet af LCM er dårligt defineret og i sig selv variabelt, hvilket resulterer i, at det er upålideligt og uegnet til en række downstream-anvendelser, navnlig dem, der specifikt vedrører NO- eller redoxbiologi, da disse kan være stærkt påvirket af tilstedeværelsen af eksogene forbindelser6. Som sådan kræver denne detaljerede protokol anvendelse af veldefineret DMEM: F12-medier med lav batch til batch-variation og tilsætning af rekombinant murin M-CSF og GM-CSF (Granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor). Desuden giver føtalt kvægserum, der typisk anvendes som supplement i vævskulturmedier, endnu en kilde til dårligt definerede forbindelser og iboende variabilitet. Det er derfor nødvendigt at kontrollere og optimere brugen af sådanne tilsætningsstoffer for at sikre en pålidelig dyrkning af BMDM'er. Ved at anvende en defineret lav-endotoksinkilde til FBS og sikre, at enkelte partier købes i bulk, defineres dyrkningsbetingelser pålideligt, og reproducerbarheden sikres. Den protokol, der er beskrevet heri, har vist sig at producere en makrofagkultur over 95% renhed, når den vurderes for makrofagoverflademarkørerne CD45 og CD11b ved flowcytometri6.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med University of Oxford etiske komité og UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Alle procedurer var i overensstemmelse med Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU.
1. Isolering af knoglemarvsceller
- Ofre vildtype (C57BL/6) eller Gch1-mangelfulde (R26-CreERT2Gchfl/fl) mus (10-16 uger gamle) ved cervikal dislokation og opsaml bagbenene.
BEMÆRK: Der foretrækkes ingen præference for begge køn. Aldersmatchede kvinder vil være lidt mindre end deres mandlige kolleger, hvilket påvirker det oprindelige udbytte af udgangsmateriale.- Sprøjt musene med 70% ethanol for at reducere risikoen for kontaminering.
- Lav et lille snit i maven med dissektionssaks for at fjerne pels og hud fra kroppen. Skræl huden af for at udsætte musklen på bagbenene.
- Placer musen på maven og forskræn bagbenene ved at løfte den fra knæleddet og lægge pres på hofterne. Forskydningen kan mærkes ved hofteleddet.
- Fjern bagbenene ved forsigtigt at skære gennem musklen ved hoften, og sørg for, at der ikke opstår skader på lårbenet.
- Skær over ankelleddet, fjern foden og rengør eventuel resterende hud fra benet.
- Læg de dissekerede ben i et 50 ml rør med 25 ml iskold PBS (intet antibiotikum kræves) og læg det på is.
BEMÆRK: Flere dyr kan dissekeres, og benene holdes på is.
- Under sterile forhold i en vævskulturhætte skal du fjerne musklerne fra benene og fjerne enderne af knoglerne for at udsætte knoglemarven.
- Læg benene i 70% ethanol i 2 minutter for at reducere forurening og vaske eventuel pels eller rester af.
- Overfør benene til en ren, steril, bakteriologisk petriskål. Brug tang og en skalpel til at skrabe fast og forsigtigt langs knoglerne med siden af bladet for at fjerne musklerne. Skær gennem sener for at lette processen.
- Fjern epifysen i ekstremiteten af hver knogle for at udsætte knoglemarven. Lårbenet skæres i begge ender, lige under de respektive led.
- Skinnebenet skæres øverst, lige under knæleddet og i bunden lige over skæringspunktet med fibulaen.
- Skyl knoglemarven fra knoglerne med PBS og saml den i et 50 ml sterilt rør.
- Fyld en 10 ml sprøjte med 10 ml PBS og fastgør den til en 25 G x 0,5 x 16 mm nål. Dette er tilstrækkeligt til at skylle alle knoglerne fra en mus.
- Indsæt nålen i knoglens medullære hulrum og skyl forsigtigt knoglemarven ud med 1-2 ml PBS, og løb nålen op og ned gennem knoglen for at sikre, at alt knoglemarv løsnes.
- Gentag for alle knogler, saml det skyllede knoglemarv i en ren petriskål.
- Brug en steril 1 ml sprøjte til at opdele knoglemarven ved at trække suspensionen ind og ud af sprøjten 5-10 gange, indtil eventuelle klumper er brudt op.
- Opsaml det disaggregerede knoglemarv i 1 ml sprøjten og før det gennem en 70 μM cellesil i et rent 50 ml centrifugerør. Læg det opsamlede knoglemarv på is, mens der indsamles yderligere prøver.
BEMÆRK: Se protokolskemaet i figur 1 - del 1.
2. Udvælgelse, differentiering og stimulering af BMDM'er
- For at fryse knoglemarv til senere brug pelletere knoglemarven ved centrifugering ved 1000 x g i 5 minutter og resuspend i 2 ml lavt endotoksin FBS indeholdende 5% dimethylsulfoxid (DMSO).
- Centrifugering af knoglemarvssuspensionen ved 1000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). En blodrød pellet vil danne sig.
- Kassér supernatanten.
- Forsigtigt resuspend pelleten i 2 ml lav-endotoksin FBS indeholdende 5% DMSO og frys ved -80 ° C natten over, før den overføres til dampfase flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
- For at bruge knoglemarv med det samme skal du lyse de røde blodlegemer, inden knoglemarven pletteres.
- Centrifugering af knoglemarvssuspensionen ved 1000 x g i 5 minutter ved RT. En blodrød pellet vil danne sig.
- Resuspend pillen i 3 ml 1x røde blodlegemer lysis buffer og inkuber ved RT i 5 minutter.
- Tilsæt 10 ml PBS og centrifuge ved 1000 x g i 5 minutter ved RT. Kassér supernatanten.
- Plade cellerne til øjeblikkelig brug ved at fortsætte fra trin 2.3.5.
- Optø makrofagerne og resuspend i 3 ml pletteringsmedier, før cellerne pilles.
- Forbered DMEM: F12 indeholdende 5% lavt endotoksin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin og 25 ng / ml M-CSF.
BEMÆRK: M-CSF og GM-CSF kan fremstilles ved at genbruge tørret protein i sterilt vand indeholdende 0,1% steril BSA, og aliquoterne kan fryses ved -80 °C til senere brug. - Optøes den frosne cellesuspension hurtigt ved 37 °C.
- Overfør cellesuspensionen (0,5 ml) til et rent, sterilt rør indeholdende 3 ml af det forberedte DMEM: F12-medie.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 1000 x g i 5 min ved RT. Kassér supernatanten.
- Resuspend pellet i 3 ml af den forberedte DMEM: F12 media.
- Tæl cellerne ved hjælp af en foretrukken metode.
- Forbered DMEM: F12 indeholdende 5% lavt endotoksin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin og 25 ng / ml M-CSF.
- Dag 0: Plade cellerne.
- Plade cellerne i ikke-TC-belagt plastvarer i DMEM: F12-medier indeholdende 5% lavt endotoksin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin og 25 ng / ml M-CSF.
BEMÆRK: Repræsentative såtætheder er beskrevet i tabel 1. Et komplet par ben fra en mus giver 15-20 millioner forløberceller. - Inkuber cellerne ved 37 °C med 5 % CO2.
- Plade cellerne i ikke-TC-belagt plastvarer i DMEM: F12-medier indeholdende 5% lavt endotoksin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin og 25 ng / ml M-CSF.
- Dag 5: Foder cellerne.
- Foder cellerne ved at tilføje 50% af det oprindelige volumen dmem: F12-medier indeholdende 5% lavt endotoksin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin og 50 ng / ml M-CSF.
- Dag 6: Stimuler cellerne med GM-CSF.
- Der tilsættes tilberedt GM-CSF til en endelig koncentration på 50 ng/ml direkte til cellekulturmediet på cellerne.
- Udskift medierne med forberedt DMEM: F12.
- Fjern alle medier fra cellerne.
- Vask cellerne kort i forvarmet PBS.
- Tilføj DMEM: F12-medier indeholdende 2% lavt endotoksin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin, 25 ng / ml M-CSF og 50 ng / ml GM-CSF.
- Aktivér makrofagerne til Fænotyperne M0, M1 eller M2 med de stimuleringer, der er beskrevet i trin 2.7.5-2.7.7.
- M0 - Ingen stimulering kræves. Inkuber cellerne natten over i medier.
- M1 - Stimuler cellerne med 100 ng / ml LPS og 10 ng / ml IFNγ (endelige koncentrationer) natten over.
- M2 - Stimuler celler med 100 ng / ml IL-4 (endelig koncentration) natten over.
- Dag 8: Høst cellerne.
- Fjern medier fra cellerne (saml medier og frys ved -80 °C for nedstrømsanalyser).
- Inkuber cellerne i iskold PBS (50% af medievolumen) i 5 minutter.
- Fjern cellerne fra pladen med skånsom skrabning eller gentagen pipettering.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 2500 x g i 5 min ved RT. Kassér supernatanten.
- Fryse cellepillerne ved -80 °C til senere brug.
BEMÆRK: Se protokolskema figur 1 - del 2.
Representative Results
Før det blev demonstreret effektiviteten af denne protokol i makrofager, nitrit og BH4 niveauer blev vurderet i medier suppleret med 10% fbs indeholdende enten 10% af LCM eller kun rekombinant M-CSF og GM-CSF. Nitrit, selv om det i lang tid betragtes som et slutprodukt af nitrogenoxidmetabolisme, betragtes nu som fysiologisk opbevaring af nitrogenoxid, som kan genanvendes, når det er nødvendigt, og derfor ofte anvendes som en indikator for nitrogenoxidbiotilgængelighed7. BH4 er en væsentlig cofaktor af NOS for NO produktion. Som det ses i figur 2, havde medier suppleret med 10% FBS lignende nitritniveauer uanset M-CSF/GM-CSF eller LCM. Imidlertid blev der observeret mere variabilitet mellem forskellige LCM-batcher. Denne observation gjaldt også BH4-målingen. Faktisk havde et parti LCM (batch # 3) et signifikant højere niveau af BH4 end de to andre (batcher # 1 og # 2). Desuden indeholdt LCM-batcher signifikant mere biopterin end medier suppleret med 10% FBS og rekombinante cytokiner. Signifikant variabilitet af totale biopteriner mellem batcher blev også målt. Disse resultater viser vigtigheden af at bruge en mindre variabel kilde til M-CSF end LCM.
Desuden indeholdt medier suppleret med 10% FBS signifikant højere niveauer af nitrit sammenlignet med medier, der indeholdt enten 2% eller 5% fbs. Forskellen mellem 10% og 5% var meget signifikant (p < 0,05) for BH4. Imidlertid blev lignende niveauer af biopteriner kvantificeret. Til sammenligning var OptiMEM + 0,2% BSA blottet for nitrit og BH4, hvilket gjorde det til et meget rent og egnet medie. Men som beskrevet af Bailey et al., Selvom OptiMEM kun er beregnet til at blive brugt en gang om natten, når man stimulerer makrofager, blev celledød på grund af sult observeret. DMEM: F12 suppleret med 2% af FBS blev valgt for at overvinde dette problem, hvilket tillod minimal nitrit og BH4-forurening, mens den indeholdt tilstrækkelige næringsstoffer til at opnå sunde celler. På trods af at der påvises noget nitrit, er niveauerne faktisk ubetydelige (~ 0,2 μM) sammenlignet med LPS / IFN-stimulerede WT-makrofager (30-80 μM for 1 x 106 celler; data ikke vist).
For at validere denne forbedrede protokol med eksperimentelle data, isolering og karakterisering af BMDM'er fra en ny BH4-mangelfuld musemodel, er R26-CreERT2Gchfl / fl præsenteret her. BH4 produceres af GTP-cyclohydrolase I (Gch1) genet. Som vist i figur 3A fører mangel i Gch1 til tab af BH4 og den deraf følgende forsvinden af NO og efterfølgende nitrit og en stigning i superoxidanion, der forårsager oxidativ stress som tidligere påvist af McNeill et al.8. Selvom denne protokol allerede er veldefineret og brugt til at dyrke andre BH4-mangelfulde makrofager fra forskellige Cre-systemer såsom Gchfl / flT2C model 6,8, er R26-CreERT2Gchfl / fl-modellen unik, da den bruger den betingede aktivering af Cre-ERT2-systemet til at fjerne Gch1-genet efter tamoxifenbehandling (figur 3B, C). Dette muliggør knockout på forskellige tidspunkter og brug af intern kontrol i form af et køretøj vs. tamoxifenbehandling. I dette eksempel blev cellerne behandlet med enten køretøj (95 % ethanol) eller 0,1/1,0 μM 4-OH tamoxifen på dag 1 og 3 (både køretøjs- og tamoxifenstamme fortyndet 1:100 i medier før 0,7/7,0 μL tilsat til 1 ml af det eksisterende dyrkningsvolumen).
Som det ses i figur 3D, afskaffes GTPCH-protein efter Tamoxifen-behandling i R26-CreERT2Gchfl/fl-cellerne , men ikke i Gchfl/fl-cellerne . Det er vigtigt, at både R26-CreERT2Gchfl / fl og Gchfl / fl kontrolceller stadig er i stand til at producere iNOS efter LPS / IFN-stimulering (figur 3B, C). Disse ændringer i Gch1-genekspression og den resulterende ændring i GTPCH-protein førte til signifikant forstyrrede intracellulære BH4-niveauer og svækket produktion af nitrit. Som vist i figur 4 udviste BMDM'er isoleret og dyrket fraR26-CreER T2Gchfl/fl-mus signifikant nedsat BH4-produktion og nedsat nitritakkumulering i medierne sammenlignet med dem fra kontrol-GCHfl/fl-celler i nærvær af tamoxifen. Tilsvarende viste de samme celler dyrket i LCM-medier også afskaffet Gch1-ekspression; selvom disse celler stadig producerede betydelige mængder af både BH4 og nitrit efter knockout af Gch1-ekspression med 4 OH tamoxifen, muligvis på grund af forurening af medier og FBS med BH4. Dette repræsenterer en klar forbedring af den nye metode i forhold til dyrkning af cellerne i L-celleholdige medier.
Yderligere karakterisering af denne model viser ingen signifikante forskelle i morfologi mellem ikke-aktiverede (M0) Gchfl/ fl og R26-CreERT2Gchfl/fl BMDM'er på dag 8 efter forskellige koncentrationer af tamoxifen. Som vist i figur 5 viser begge modeller en tilsvarende mængde klæbende celler lavet af en rund form med aflange ekstremiteter, typisk de funktioner, der forventes af ustimulerede makrofager9.
Samlet set viser disse resultater, at denne metode til isolering og dyrkning af BMDM'er giver en ren population af celler, der er egnede til dyrkning af murine makrofager. Denne metode muliggør dyrkning af murine makrofager uden indblanding af eksogene forbindelser, der er til stede i nogle medieformuleringer.
Figur 1: Skematisk diagram, der illustrerer knoglemarvscellernes isolering (del 1) til udvælgelse, differentiering og stimulering af BMDM'er (del 2). (A) Under sterile forhold anbringes dissekerede ben i en ren bakteriologisk petriskål efter at være blevet vasket i 70% ethanol. (B) Muskler fjernes forsigtigt ved hjælp af tang og skalpelskrab langs knoglerne. (C) Knoglernes ekstremiteter skæres derefter af for at udsætte knoglemarven. (D) Knoglemarven skylles fra knoglerne ved hjælp af en 10 ml sprøjte fyldt med 10 ml PBS ved at indsætte nålen i knoglens lumen. (E) Nålen køres op og ned gennem knoglen for at sikre, at al knoglemarv løsnes. Knoglen skal fremstå hvid og klar på det tidspunkt med det løsrevne knoglemarv opsamlet i petriskålen. (F-G) Gentag for alle knogler, opsaml det disaggregerede knoglemarv i 1 ml sprøjten, og før det gennem en 70 μm cellesil i et rent 50 ml centrifugerør. Spin ned og resuspend celler i frysemedier til senere brug. Del 2 viser udvælgelse, differentiering og stimulering af BMDM'er Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nitrit- og BH4-niveauer i DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF eller DMEM: F12+ L-cellemedier. (A) Nitritniveauer i forskellige medier blev målt ved hjælp af Griess Assay-metoden. B) BH4- og biopterinniveauerne blev målt i forskellige medier ved HPLC-kvantificering ved hjælp af en BH4-standard. Data udtrykkes som middelværdien (n = 3) ± SD. Data blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA ved flere sammenligninger. Symboler repræsenterer p < 0,05 mellem grupper. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Introduktion til R26CreERT2-modellen. (A) Skema, der illustrerer BH4's rolle som NOS-cofaktor i redoxbiologi. B) Skematisk beskrivelse af excisionen af de kritiske exons (2 og 3) i Gch1 på grund af de flankerende loxP-lokaliteter og den betingede aktivering af Cre-ERT2 med tamoxifen i denne murinemodel. C) PCR (repræsentativ for n = 3 uafhængige dyr), der påviser udskæring af den kritiske exon, når BMDM'er behandles med tamoxifen. WT-mus producerer et 1030 bp PCR-produkt, mens der i nærværelse af Cre produceres et 1392 bp-produkt, der bekræfter udskæring af de kritiske exons. D) Immunoblot af iNOS, GCH og B-tubulin (repræsentativ for n = 3 uafhængige dyr). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Karakterisering af BH4-mangel i makrofager. (A,B) qRT-PCR bekræfter tab af Gch1-ekspression i R26-CreERT2Gchfl/fl-modellen behandlet med tamoxifen. Blå = Ny MCSF-metode, Grøn = klassisk LCM-metode. (C,D) HpLC's analyse af intracellulær BH4 viser, at 0,1 μM og 1,0 μM er tilstrækkelige til at mindske BH4-niveauerne betydeligt. (E, F) Måling af nitrit i medier ved hjælp af Griess-assayet viser, at ustimulerede BMDM'er ikke producerer påviselige niveauer af nitrit, mens Gchfl / fl og R26-CreERT2Gchfl / fl BMDM'er producerer nitrit i nærvær af LPS / IFNγ. Signifikant reducerer tamoxifenbehandling af R26-CreERT2Gchfl / fl signifikant nitritniveauer i stimulerede BMDM'er. Data udtrykkes som gennemsnittet af (n = 3) ± SD. Data blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA ved flere sammenligninger. Symboler repræsenterer p < 0,05 mellem grupper. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af BMDMs morfologi. Fotos opnået ved optisk mikroskopi af BMDM'er på dag 8 med varierende behandling af tamoxifen. Skala er angivet på billedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Kultur skål | Medievolumen | Såning tæthed |
| 12 brønd skål | 1 ml | 500.000 celler |
| 6 brønd skål | 2 ml | 1.000.000 celler |
| 100 mm fad | 10 ml | 3.000.000 celler |
| 75 cm2 kolbe | 15 ml | 5.000.000 celler |
Tabel 1: Repræsentative såtætheder.
Discussion
Denne BH4- og NO-mangelfulde BMDMs-kulturprotokol er designet til at undersøge NO-redoxbiologi i primære makrofager gennem reduktion af tetrahydrobiopterin (BH4) og andre interfererende artefakter med det formål at forbedre pålideligheden og reproducerbarheden af resultater opnået fra disse eksperimentelle modeller.
Kritiske trin omfatter brugen af de korrekte plastvarer. Makrofagforfædere er klæbende celler og meget klæbrige; Derfor er anvendelsen af ikke-vævskultur (TC) behandlede plader afgørende for at udvælge og isolere dem fra andre stamceller, som ellers kunne binde og reducere renheden. På høstdagen kræver afkørsel af makrofager fra plader iskold PBS, men ved hjælp af EDTA eller endda skrabeceller meget forsigtigt kan udføres afhængigt af downstream-applikationen (f.eks. Lyseret versus levende celler eksperiment). Der skal også udvises særlig forsigtighed med hensyn til forurening. Under skylning af knoglemarven kan der forekomme potentiel krydskontaminering med bakterier eller virale partikler fra rester af pels og hud. Det er derefter vigtigt at være så forsigtig og steril som muligt; derfor tilskyndes der til at kaste dissekerede ben i 70% ethanol i få minutter. Tilsvarende anbefales det stærkt at bruge antibiotika, mens makrofager dyrkes.
En anden begrænsning af denne protokol stammer fra cellebelægningstætheden på dag 0. Skyllet knoglemarv indeholder en række celler, som fejlagtigt kan tælles og inkluderes som makrofagforfædere, hvilket fører til et falsk samlet celleantal. For at undgå den efterfølgende og potentielle variabilitet kan isolerede makrofager skylles forsigtigt ved hjælp af varm PBS på dag 7 og genbelægges ved den korrekte densitet i 2% FBS DMEM: F12 mindst 1 time før stimulering for at tillade vedhæftning.
Endelig er det bydende nødvendigt at kontrollere nitritniveauerne ved Hjælp af Griess-assay ved hjælp af medier fra dyrkede makrofager for at analysere data. På plussiden er dette assay hurtigt og billigt at udføre.
Som det fremgår heri, er denne tilpassede protokol et mere defineret og forbedret alternativ til den mere almindelige protokol, der bruges til at isolere og dyrke makrofager ved hjælp af L-cellekonditionerede medier (LCM). Faktisk er en af de største bekymringer ved at bruge LCM, når man studerer NO-redoxbiologi, dens betydelige mængder biopteriner, der opdages, hvilket fører til potentielle metaboliske ændringer10. For eksempel kan eksogen BH4 hurtigt genopbygge mangelfulde modeller og fungere som en cofaktor for iNOS, hvilket fører til uønsket produktion af nitrogenoxid. En anden ulempe ved at bruge LCM ligger i dens produktion - LCM er en blanding af kolonistimulerende faktorer, cytokiner og andre biprodukter, der udskilles direkte af L-929-celler, som alle kan påvirke makrofagfysiologi6. På trods af det store udbud i M-CSF, der er afgørende for makrofagspredning og overlevelse, øger variationen af hver komponent fra batch til batch risikoen for variabilitet på tværs af eksperimenter.
For at løse begge problemer bruger denne nye protokol det veldefinerede DMEM: F12-medie, der indeholder lave niveauer af biopteriner, hvortil der tilføjes en kontrolleret mængde renset M-CSF og GM-CSF. Begge cytokiner hjælper med differentiering og vækst af makrofager. M-CSF fører især til generering af BMDM'er fra knoglemarvsstamceller ved at sikre differentiering af hæmatopoietiske stamceller i makrofager11. Derudover har GM-CSF vist sig at øge inflammatorisk cytokin og NO-produktion, når den tilsættes før stimulering, en reel fordel, når man studerer NO-redoxbiologi12,13.
Den anden hovedfaktor, som denne nye metode adresserer, er FBS, der normalt bruges som en kilde til næringsstoffer, der er afgørende for cellernes gode sundhed og vækst. I lighed med LCM indeholder FBS betydelige niveauer af biopterin. Mens fuldstændig serumsult af cellerne før stimulering oprindeligt blev overvejet ved anvendelse af OptiMEM + 0,2% BSA, viste makrofager tegn på løsrivelse, hvilket indikerer nedsat cellelevedygtighed som beskrevet af Bailey et al.6. Da makrofager imidlertid viste et absolut krav til serum, blev Ultra-Low Enddotoxin FBS fra BioWest valgt. Batches blev testet for biopteriner og udvalgt på forhånd inden bulkkøbet for at sikre en pålidelig og veldefineret forsyning. For at gå videre med målet om at reducere forurenende kilder til biopteriner blev der derfor testet nedsatte koncentrationer af FBS. I stedet for at bruge 10% serum som almindeligt anvendt i cellekultur, holdes FBS-niveauet på 5% gennem hele 7-dages differentieringen af knoglemarv i makrofager og reduceres yderligere til 2% under stimulering natten over på den sidste dag. Dette sikrer ubetydelige niveauer af påviste biopteriner, men nok næringsstoffer til et godt helbred og vedhæftning af makrofager. Selvom denne nyligt optimerede protokol ved hjælp af rekombinant M-CSF resulterer i et mere kontrolleret miljø for dyrkning og aktivering af primære makrofager, er hovedbegrænsningen, at denne metode er dyrere end at bruge LCM-metoden.
Under hensyntagen til alle disse faktorer blev de to metoder derefter direkte sammenlignet. Det er vigtigt, at den nyligt ændrede protokol, der blev præsenteret heri ved hjælp af rekombinant M-CSF og GM-CSF, resulterede i et mere reproducerbart system, hvor medierne var blottet for forurening af BH4. Virkningerne af dette var dobbelte; BH4-mangelfulde celler manglede virkelig BH4, hvilket resulterede i minimal detekterbar nitritakkumulering i medierne efter stimulering til M1-status med LPS. Dette var i modsætning til de samme BMDM-celler dyrket i LCM, hvor signifikant BH4 og nitrit blev påvist.
Afslutningsvis ligger styrken ved denne metode i bestræbelserne på at kontrollere biopterinniveauerne ved grundigt at vurdere hver parameter, der kan påvirke NO- og redoxsignalering i makrofager. Dette sikrer især maksimal reproducerbarhed og standardisering inden for NO-redoxbiologiområdet.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af British Heart Foundation Intermediate Fellowship tildelt M.J.C. (FS/14/56/31049), British Heart Foundation Programme tilskud (RG/17/10/32859 og RG/12/5/29576), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) og NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Center. Forfatterne vil også gerne anerkende støtte fra BHF Centre of Research Excellence, Oxford (RE/13/1/30181 og RE/18/3/34214)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
- Zajd, C. M., et al. Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used. Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Zhao, Y. L., et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow. Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).
- Nasser, H., et al. Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages. Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).
- Stanley, E. R., Heard, P. M. Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells. Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
- Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
- McNeill, E., et al. Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Bailey, J. D., et al. Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation. Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).
- Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).
- Na, Y. R., et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).
- Sorgi, C. A., et al. GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands. PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).
