Préparation de microcapsules multifonctionnelles à base de soie chargées de plasmides d’ADN codant pour des aptamères d’ARN et des riboswitches
Summary
Le protocole décrit la formation de microcapsules chargées d’ADN robustes et biocompatibles sous forme de biocapteurs in vitro multiplexés capables de suivre plusieurs ligands.
Abstract
Nous introduisons un protocole pour la préparation de microcapsules de fibroïne de soie chargées d’ADN via la méthode d’assemblage couche par couche (LbL) sur des noyaux sphériques sacrificiels. Après l’adsorption d’une couche première et de plasmides d’ADN, la formation de microcapsules robustes a été facilitée par l’induction de feuilles de β dans la structure secondaire de la soie lors de la déshydratation aiguë d’une seule couche de soie. Par conséquent, la stratification s’est produite via de multiples liaisons hydrogène et interactions hydrophobes. Lors de l’adsorption de coquilles multicouches, les structures noyau-coquille peuvent être fonctionnalisées davantage avec des nanoparticules d’or (AuNP) et / ou des anticorps (IgG) à utiliser pour la télédétection et / ou la livraison ciblée. L’ajustement de plusieurs paramètres clés lors du dépôt séquentiel de macromolécules clés sur des noyaux de silice, tels que la présence d’un apprêt polymère, la concentration d’ADN et de protéines de soie, ainsi qu’un certain nombre de couches adsorbées, a abouti à des microcapsules biocompatibles chargées d’ADN avec une perméabilité et des charges d’ADN variables. Lors de la dissolution des noyaux de silice, le protocole a démontré la formation de microcapsules creuses et robustes avec des plasmides d’ADN immobilisés sur la surface interne de la membrane de la capsule. La création d’une membrane biocompatible sélectivement perméable entre les plasmides d’ADN et l’environnement externe a préservé l’ADN pendant le stockage à long terme et a joué un rôle important dans l’amélioration de la réponse de sortie des plasmides confinés dans l’espace. L’activité des modèles d’ADN et leur accessibilité ont été testées lors de réactions de transcription et de traduction in vitro (systèmes acellulaires). Les plasmides d’ADN codant pour les aptamères et les riboswitches d’ARN ont été activés avec succès avec les analytes correspondants, comme cela a été visualisé lors de la localisation de transcrits d’ARN marqués par fluorescence ou de la protéine GFPa1 dans les membranes de la coquille.
Introduction
Le domaine de la biologie synthétique offre des opportunités uniques de développer des capacités de détection en exploitant les mécanismes naturels développés par les micro-organismes pour surveiller leur environnement et les menaces potentielles. Il est important de noter que ces mécanismes de détection sont généralement liés à une réponse qui protège ces micro-organismes contre l’exposition nocive, régulant l’expression des gènes pour atténuer les effets négatifs ou empêcher l’absorption de matières toxiques. Des efforts importants ont été déployés pour concevoir ces microorganismes afin de créer des capteurs de cellules entières tirant parti de ces réponses naturelles, mais en les redirigeant pour reconnaître de nouvelles cibles et/ou produire un signal mesurable pouvant être mesuré à des fins de quantification (généralement la fluorescence)1,2. Actuellement, les préoccupations concernant l’utilisation de micro-organismes génétiquement modifiés (OGM), en particulier lorsqu’ils sont disséminés dans l’environnement ou le corps humain, en raison de fuites de cellules entières ou d’une partie de leur matériel génétique, même encapsulées dans une matrice polymère, suggèrent que d’autres moyens d’exploiter ces approches de détection sont nécessaires3.
Une approche puissante pour exploiter les avantages de la détection basée sur les micro-organismes sans se soucier du déploiement d’OGM est l’utilisation de systèmes de transcription/traduction in vitro (IVTT). D’un point de vue pratique, les systèmes IVTT consistent en un mélange contenant la plupart des composants cellulaires à l’état actif qui a été « extrait » des cellules par différents moyens, y compris la sonication, le battement de perles ou autres4. Le produit final de ce procédé est un mélange réactionnel biochimique déjà optimisé pour effectuer la transcription et la traduction qui peut être utilisé pour tester différents capteurs dans un format « récipient ouvert », sans les contraintes liées à l’utilisation de cellules entières (diffusion membranaire, efficacité de transformation, toxicité cellulaire, etc.). Il est important de noter que différents composants de capteurs peuvent être ajoutés quantitativement et leur effet étudié par différentes techniques optiques et spectrométriques, comme nous l’avons démontré5. Il a été remarqué que les performances des systèmes IVTT peuvent être incohérentes; Cependant, des études récentes ont montré des approches pour standardiser leur préparation et leur caractérisation, ce qui est d’une grande aide lors de l’étude de leurs performances dans la conception de capteurs6. Récemment, de nombreux exemples de systèmes IVTT utilisés pour créer des tests sur papier grâce à la lyophilisation de leurs composants dans des matrices papier ont été démontrés, y compris la détection d’ions de métaux lourds, de médicaments, d’éléments de détection de quorum et autres 7,8,9. Un espace d’application passionnant pour les capteurs basés sur IVTT est leur utilisation dans des applications de détection dans différents types d’environnements, y compris le sol, l’eau et le corps humain. Afin de déployer ces systèmes IVTT dans ces environnements difficiles, une approche d’encapsulation doit être mise en œuvre pour contenir les composants IVTT et les protéger de la dégradation.
Les approches d’encapsulation les plus courantes pour les systèmes IVTT comprennent l’utilisation de capsules lipidiques, de micelles, de polymères et d’autres microconteneurs hermétiquement fermés10,11,12. L’un des inconvénients de cette approche est la nécessité d’incorporer des mécanismes passifs ou actifs pour transporter les matériaux à l’intérieur et à l’extérieur des conteneurs afin de permettre la communication avec l’environnement extérieur et de fournir des capacités de détection. Pour surmonter certains de ces problèmes, l’étude présente une méthode qui fournit une approche simple mais efficace pour encapsuler les matériaux de codage pour différentes conceptions de capteurs à exprimer dans les systèmes IVTT. Cette approche est basée sur l’utilisation du dépôt couche par couche (LbL) d’un biopolymère en présence des plasmides d’intérêt pour créer des microcapsules creuses à porosité élevée, ce qui permet au matériel génétique protégé d’interagir avec les différents composants de l’IVTT de choix. L’étude a démontré que les plasmides encapsulés pouvaient diriger la transcription et la traduction lorsqu’ils étaient activés dans cette matrice polymère, comme le montre la réponse d’un aptamère codé par un plasmide et d’un riboswitch à leurs cibles correspondantes. De plus, ce revêtement LbL protège les plasmides pendant des mois sans conditions de stockage particulières.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des microcapsules d’hydrogel sélectivement perméables chargées de différents types de conceptions de capteurs codés par l’ADN peuvent être préparées en suivant ce protocole. L’une des caractéristiques distinctives de l’approche LbL est la capacité d’adapter la complexité des microcapsules lors de l’assemblage ascendant, qui commence généralement par l’adsorption d’espèces moléculaires sur des modèles sacrificiels. En ajustant soigneusement les concentrations des composants initiaux, les co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention LRIR 16RH3003J du Bureau de la recherche scientifique de l’armée de l’air, ainsi que par le programme Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S & T Priorities (ARAP) du Bureau du sous-secrétaire à la Défense pour la recherche et l’ingénierie des États-Unis.
La séquence plasmidique vectorielle de ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) a été généreusement fournie par le Dr J. Gallivan. Les cocons de vers à soie de Bombyx mori ont été généreusement donnés par le Dr D.L. Kaplan de l’Université Tufts, MA.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
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