מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים
Summary
עבודה זו מתארת את הכנת תמצית התאים מ-Escherichia coli (E. coli) ולאחר מכן תגובות של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) תוך פחות מ-24 שעות. הסבר על פרוטוקול אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI) מפרט שיפורים שנעשו כדי להפחית את הפיקוח על החוקרים ולהגדיל את כמויות תמצית התאים המתקבלות.
Abstract
סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) גדלה כפלטפורמה ביוטכנולוגית הלוכדת מכונות שעתוק ותרגום במבחנה. התפתחויות רבות הפכו את פלטפורמת CFPS לנגישה יותר למשתמשים חדשים והרחיבו את מגוון היישומים. עבור מערכות CFPS מבוססות ליסאט, ניתן להפיק תמציות תאים ממגוון אורגניזמים, ולרתום את הביוכימיה הייחודית של אותו פונדקאי כדי להגביר את סינתזת החלבונים. במהלך 20 השנים האחרונות, Escherichia coli (E. coli) הפך לאחד האורגניזמים הנפוצים ביותר לתמיכה ב- CFPS בשל יכולתו הכלכלית והרבגוניות שלו. למרות ההתקדמות העיקרית הרבה, זרימת העבודה להכנת תמצית תאי E. coli נותרה צוואר בקבוק מרכזי עבור משתמשים חדשים כדי ליישם CFPS עבור היישומים שלהם. זרימת העבודה של הכנת החילוץ היא עתירת זמן ודורשת מומחיות טכנית כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. כדי להתגבר על מחסומים אלה, דיווחנו בעבר על פיתוח של זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית (CFAI) הפועלת 24 שעות ביממה ללא תאים, המפחיתה את קלט המשתמש ואת המומחיות הטכנית הנדרשת. זרימת העבודה של CFAI ממזערת את העבודה ואת המיומנות הטכנית הנדרשת ליצירת תמציות תאים תוך הגדלת הכמויות הכוללות של תמציות תאים המתקבלות. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה הזו באופן שלב אחר שלב כדי לשפר את הגישה ולתמוך ביישום הרחב של CFPS מבוסס E. coli .
Introduction
השימוש בסינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) ליישומי ביוטכנולוגיה גדל משמעותית בשנים האחרונות 1,2,3. ניתן לייחס התפתחות זו בחלקה למאמצים מוגברים בהבנת התהליכים המתרחשים ב- CFPS ובתפקידו של כל רכיב 4,5. בנוסף, עלויות מופחתות המיוחסות לתפאורות ממוטבות ולמקורות אנרגיה חלופיים הפכו את הטכנולוגיה נטולת התאים לקלה יותר ליישום עבור משתמשים חדשים 6,7,8,9. על מנת ליישם את גורמי השעתוק והתרגום הדרושים לסינתזת חלבונים, תמצית התא משמשת לעתים קרובות להנעת תגובות ללא תאים10. מדריכי משתמשים שפורסמו לאחרונה סיפקו פרוטוקולים פשוטים להפקת תמצית פונקציונלית, מה שמקל על היישום עבור משתמשים חדשים ומנוסים כאחד 1,11,12,13,14. תמצית תאים מתקבלת בדרך כלל באמצעות תזה של תרבית תאים, אשר ניתן לגדל באמצעות אורגניזמים שונים בהתאם לשימוש הספציפי הרצוי 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) הפך במהירות לאחד האורגניזמים המארחים הנפוצים ביותר לייצור תמציות פונקציונליות17. זן BL21 Star (DE3) מועדף מכיוון שהוא מסיר את הפרוטאזות מהממברנה החיצונית (OmpT פרוטאז) והציטופלסמה (Lon protease), ומספק סביבה אופטימלית לביטוי החלבון הרקומביננטי. בנוסף, ה-DE3 מכיל את ה-λDE3 שנושא את הגן עבור T7 RNA פולימראז (T7 RNAP) תחת שליטתו של מקדם ה-lacUV5; רכיב הכוכב מכיל גן RNaseE שעבר מוטציה המונע ביקוע של mRNA 4,14,18,19. תחת מקדם lacUV5, אינדוקציה של איזופרופיל-תיוגלאקטופירנוזיד (IPTG) מאפשרת ביטוי של T7 RNAP20,21. זנים אלה משמשים לגידול וקציר תאים, אשר נותנים חומר גלם להכנת תמצית. ניתן לבצע ליזיס של תאים במגוון שיטות, כולל הכאת חרוזים, עיתונות צרפתית, הומוגניזציה, סוניקציה וקוויטציה של חנקן 1,11,12,22.
תהליך תרביות החיידקים והקציר עקבי ברוב הפלטפורמות בעת שימוש ב-E. coli, אך דורש מספר ימים ופיקוח אינטנסיבי של החוקריםעל 1,11,13. תהליך זה מתחיל בדרך כלל בתרבית זרעי לילה במרק LB, אשר עם צמיחת הלילה מחוסנת לתרבית גדולה יותר של 2xYTPG (שמרים, טריפטון, מאגר פוספטים, גלוקוז) למחרת. הצמיחה של תרבית גדולה יותר זו מנוטרת עד שהיא מגיעה לשלב הלוג המוקדם עד אמצע, בצפיפות אופטית (OD) של 2.514,20. נדרשת מדידה מתמדת מכיוון שמרכיבי התעתיק והתרגום הוכחו בעבר כפעילים מאוד בשלב הלוג המוקדם עד אמצע23,24. בעוד שתהליך זה יכול ליצור תמצית הניתנת לשחזור, המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה שיטה חדשה באמצעות מדיה אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI), אשר מפחיתה את הפיקוח על החוקרים, מגדילה את התפוקה הכוללת של תמצית עבור ליטר נתון של תרבית תאים, ומשפרת את הגישה להכנת תמצית מבוססת E. coli עבור משתמשים מנוסים וחדשים כאחד (איור 1 ). כאן אנו מספקים את המדריך שלב אחר שלב ליישום זרימת העבודה של CFAI, כדי לעבור מלוח תאים מפוספס לתגובת CFPS שהושלמה תוך 24 שעות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיקוח על חוקרים נחוץ באופן מסורתי לשתי פעולות מפתח במהלך גדילת התאים: אינדוקציה של T7 RNAP ותאי קצירת תאים ב-OD600 ספציפי. CFAI מייתר את שתי הדרישות הללו כדי להפחית את הזמן וההכשרה הטכנית הנדרשת לחוקר על מנת להכין תמציות תאים באיכות גבוהה. אינדוקציה אוטומטית של T7 RNAP מושגת על ידי החלפת גלוקוז …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד”ר ג’ניפר ונדרקלן ולאנדראה לובשר על התמיכה הטכנית. המחברים רוצים להודות גם לניקול גרגוריו, מקס לוין, אליסה מולין, ביונגצ’ול סו, אוגוסט ברוקוול, אליזבת (ליזי) וויבודה, לוגן ברינגטון וג’יליאן קסמן על דיונים מועילים. המחברים מכירים גם בתמיכת מימון מקרן ביל ולינדה פרוסט, המרכז ליישומים במענק המחקר היישומי של שברון ביוטכנולוגיה, Cal Poly Research, Scholarly והקרן הלאומית למדע (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
References
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
