Hücresiz Otomatik İndüksiyon İş Akışını Kullanarak 24 Saat İçinde Hücrelerden Hücresiz Protein Sentezine
Summary
Bu çalışma, Escherichia coli’den (E. coli ) hücre ekstraktının hazırlanmasını ve ardından 24 saatten kısa sürede hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını açıklamaktadır. Hücresiz otoindüksiyon (CFAI) protokolünün açıklaması, araştırmacı gözetimini azaltmak ve elde edilen hücre ekstraktı miktarlarını artırmak için yapılan iyileştirmeleri detaylandırmaktadır.
Abstract
Hücresiz protein sentezi (CFPS), transkripsiyon ve çeviri makinelerini in vitro olarak yakalayan bir biyoteknoloji platformu olarak büyümüştür. Çok sayıda gelişme, CFPS platformunu yeni kullanıcılar için daha erişilebilir hale getirdi ve uygulama yelpazesini genişletti. Lisat bazlı CFPS sistemleri için, hücre ekstraktları çeşitli organizmalardan üretilebilir ve protein sentezini arttırmak için bu konağın benzersiz biyokimyasından yararlanılabilir. Son 20 yılda, Escherichia coli (E. coli), satın alınabilirliği ve çok yönlülüğü nedeniyle CFPS’yi desteklemek için en yaygın kullanılan organizmalardan biri haline gelmiştir. Çok sayıda önemli ilerlemeye rağmen, E. coli hücre ekstraktı hazırlama iş akışı, yeni kullanıcıların uygulamaları için CFPS’yi uygulamaları için uygulamaları için önemli bir darboğaz olmaya devam etmiştir. Ekstrakt hazırlama iş akışı zaman alıcıdır ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için teknik uzmanlık gerektirir. Bu engellerin üstesinden gelmek için, daha önce kullanıcı girdisini ve gerekli teknik uzmanlığı azaltan 24 saat hücresiz otomatik indüksiyon (CFAI) iş akışının geliştirildiğini bildirmiştik. CFAI iş akışı, hücre ekstraktları üretmek için gereken işçiliği ve teknik beceriyi en aza indirirken, elde edilen toplam hücre ekstresi miktarlarını da arttırır. Burada, erişimi iyileştirmek ve E. coli tabanlı CFPS’nin geniş kapsamlı uygulamasını desteklemek için bu iş akışını adım adım açıklıyoruz.
Introduction
Biyoteknoloji uygulamaları için hücresiz protein sentezinin (CFPS) kullanımı son birkaç yılda önemli ölçüde artmıştır 1,2,3. Bu gelişme kısmen, CFPS’de meydana gelen süreçleri ve her bir bileşenin rolünü anlamada artan çabalara bağlanabilir 4,5. Ek olarak, optimize edilmiş kurulumlara ve alternatif enerji kaynaklarına atfedilen azaltılmış maliyetler, hücresiz teknolojinin yeni kullanıcılar için uygulanmasını kolaylaştırmıştır 6,7,8,9. Protein sentezi için gerekli transkripsiyon ve translasyon faktörlerini uygulamak için, hücre ekstresi genellikle hücresiz reaksiyonları yönlendirmek için kullanılır10. Son zamanlarda yayınlanan kullanım kılavuzları, işlevsel özüt üretmek için basit protokoller sağlamış ve1,11,12,13,14 gibi yeni ve deneyimli kullanıcılar için uygulamayı kolaylaştırmıştır. Hücre ekstraktı genellikle, istenen spesifik kullanıma bağlı olarak farklı organizmalar kullanılarak yetiştirilebilen bir hücre kültürünün lizisi yoluyla elde edilir 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) hızla fonksiyonel ekstraktlar üretmek için en yaygın kullanılan konakçı organizmalardan biri haline gelmiştir17. BL21 Star (DE3) suşu tercih edilir, çünkü proteazları dış zardan (OmpT proteaz) ve sitoplazmadan (Lon proteaz) uzaklaştırır ve rekombinant protein ekspresyonu için en uygun ortamı sağlar. Ek olarak, DE3, lacUV5 promotörünün kontrolü altında T7 RNA polimeraz (T7 RNAP) genini taşıyan λDE3’ü içerir; yıldız bileşeni, mRNA4,14,18,19’un bölünmesini önleyen mutasyona uğramış bir RNaseE geni içerir. LakUV5 promotörü altında, izopropil-tiyogalaktopiranosid (IPTG) indüksiyonu, T7 RNAP20,21’in ekspresyonuna izin verir. Bu suşlar, ekstrakt hazırlanması için hammadde veren hücrelerin büyümesi ve toplanması için kullanılır. Hücre lizisi, boncuk çırpma, Fransız presi, homojenizasyon, sonikasyon ve azot kavitasyonu1,11,12,22 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Bakteri kültürü ve hasat süreci, E. coli kullanırken çoğu platformda tutarlıdır, ancak birkaç gün ve yoğun araştırmacı gözetimi gerektirir 1,11,13. Bu işlem genellikle LB suyunda bir gecede tohum kültürü ile başlar, bu da gece büyümesi üzerine ertesi gün daha büyük bir 2xYTPG kültürüne (maya, tripton, fosfat tamponu, glikoz) aşılanır. Bu daha büyük kültürün büyümesi, 2.5 14,20’lik bir optik yoğunlukta (OD) erken-orta log fazına ulaşana kadar izlenir. Transkripsiyon ve çeviri bileşenlerinin daha önce23,24 erken ve orta log fazında oldukça aktif olduğu gösterildiğinden sürekli ölçüm gereklidir. Bu işlem tekrarlanabilir ekstrakt oluşturabilse de, laboratuvarımız yakın zamanda araştırmacı gözetimini azaltan, belirli bir litre hücre kültürü için ekstraktın genel verimini artıran ve hem deneyimli hem de yeni kullanıcılar için E. coli bazlı ekstrakt preparatına erişimi artıran Hücresiz Otomatik İndüksiyon (CFAI) Ortamını kullanarak yeni bir yöntem geliştirmiştir (Şekil 1 ). Burada, CFAI iş akışını uygulamak için, çizgili bir hücre plakasından 24 saat içinde tamamlanmış bir CFPS reaksiyonuna geçmek için adım adım kılavuz sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre büyümesi sırasında iki temel eylem için geleneksel olarak araştırmacı gözetimine ihtiyaç vardır: T7 RNAP’nin indüksiyonu ve belirli bir OD600’de hücrelerin toplanması. CFAI, araştırmacının zamanını ve yüksek kaliteli hücre ekstraktları hazırlamak için gereken teknik eğitimi azaltmak için bu gereksinimlerin her ikisini de ortadan kaldırır. T7 RNAP’nin otomatik indüksiyonu, glikozun ortamdaki birincil şeker olarak laktoz ile değiştirilmesi, büyümenin aktif olarak izlenme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, teknik destek için Dr. Jennifer VanderKelen ve Andrea Laubscher’a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yararlı tartışmalar için Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Voyvoda, Logan Burrington ve Jillian Kasman’a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Bill ve Linda Frost Fonu, Biyoteknoloji Uygulamaları Merkezi’nin Chevron Biyoteknoloji Uygulamalı Araştırma Bağış Bursu, Cal Poly Research, Bilimsel ve Ulusal Bilim Vakfı’ndan (NSF-1708919) finansman desteğini de kabul ediyor.
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
References
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
