De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células
Summary
Este trabalho descreve a preparação do extrato celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em menos de 24 horas. Explicação do protocolo de autoindução automática livre de células (CFAI) detalha melhorias feitas para reduzir a supervisão dos pesquisadores e aumentar as quantidades de extrato celular obtidos.
Abstract
A síntese de proteínas sem células (CFPS) cresceu como uma plataforma de biotecnologia que captura a transcrição e a máquina de tradução in vitro. Inúmeros desenvolvimentos tornaram a plataforma CFPS mais acessível aos novos usuários e expandiram a gama de aplicativos. Para sistemas cfps baseados em lysate, extratos celulares podem ser gerados a partir de uma variedade de organismos, aproveitando a bioquímica única desse hospedeiro para aumentar a síntese proteica. Nos últimos 20 anos, escherichia coli (E. coli) tornou-se um dos organismos mais utilizados para apoiar cfps devido à sua acessibilidade e versatilidade. Apesar de inúmeros avanços importantes, o fluxo de trabalho para a preparação do extrato de células E. coli tem permanecido um gargalo fundamental para que novos usuários implementem CFPS para suas aplicações. O fluxo de trabalho de preparação do extrato é demorado e requer conhecimento técnico para alcançar resultados reprodutíveis. Para superar essas barreiras, relatamos anteriormente o desenvolvimento de um fluxo de trabalho de autoindução livre de células 24 horas (CFAI) que reduz a entrada do usuário e a experiência técnica necessária. O fluxo de trabalho do CFAI minimiza a habilidade laboral e técnica necessária para gerar extratos celulares, ao mesmo tempo em que aumenta as quantidades totais de extratos celulares obtidos. Aqui descrevemos esse fluxo de trabalho de forma passo a passo para melhorar o acesso e apoiar a ampla implementação do CFPS baseado em E. coli .
Introduction
O uso de síntese de proteínas livres de células (CFPS) para aplicações de biotecnologia cresceu substancialmente nos últimos anos 1,2,3. Esse desenvolvimento pode ser atribuído, em parte, ao aumento dos esforços na compreensão dos processos que ocorrem no CFPS e ao papel de cada componente 4,5. Além disso, os custos reduzidos atribuídos a configurações otimizadas e fontes alternativas de energia tornaram a tecnologia livre de células mais fácil de implementar para novos usuários 6,7,8,9. Para implementar os fatores necessários de transcrição e tradução para a síntese proteica, o extrato celular é frequentemente usado para conduzir reações livres de células10. Os guias de usuários publicados recentemente forneceram protocolos simples para a produção de extrato funcional, facilitando a implementação de usuários novos e experientes, tanto 1,11,12,13,14. O extrato celular é geralmente obtido através da lise de uma cultura celular, que pode ser cultivada usando diferentes organismos dependendo do uso específico desejado 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) tornou-se rapidamente um dos organismos hospedeiros mais utilizados para a produção de extratos funcionais17. A cepa BL21 Star (DE3) é preferida porque remove as proteases da membrana externa (OmpT protease) e do citoplasma (Lon protease), proporcionando um ambiente ideal para a expressão proteica recombinante. Além disso, o DE3 contém o λDE3 que carrega o gene para a polimerase T7 RNA (T7 RNAP) sob o controle do promotor lacUV5; o componente estelar contém um gene RNaseE mutado que previne o decote de mRNA 4,14,18,19. Sob o promotor lacUV5, a indução isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) permite a expressão de T7 RNAP20,21. Essas cepas são usadas para cultivar e colher células, que dão matéria-prima para preparação de extratos. A lise celular pode ser realizada usando uma variedade de métodos, incluindo batida de contas, prensa francesa, homogeneização, sônica e cavitação de nitrogênio 1,11,12,22.
O processo de cultura bacteriana e colheita é consistente na maioria das plataformas ao usar E. coli, mas requer vários dias e intensa supervisão de pesquisadores 1,11,13. Este processo geralmente começa com uma cultura de sementes durante a noite no caldo LB, que após o crescimento da noite para o dia é então inoculado em uma cultura maior de 2xYTPG (levedura, triptona, tampão de fosfato, glicose) no dia seguinte. O crescimento dessa cultura maior é monitorado até chegar à fase de troncos do início ao meio, a uma densidade óptica (OD) de 2,514,20. A medição constante é necessária, pois os componentes da transcrição e da tradução foram previamente demonstrados como altamente ativos na fasede log 23,24 do início ao meio. Embora esse processo possa criar extrato reprodutível, nosso laboratório desenvolveu recentemente um novo método usando a Mídia de Autoindução Livre de Células (CFAI), que reduz a supervisão dos pesquisadores, aumenta o rendimento global do extrato para um determinado litro de cultura celular e melhora o acesso à preparação de extratos baseados em E. coli para usuários experientes e novos (Figura 1 ). Aqui fornecemos o guia passo-a-passo para implementar o fluxo de trabalho DO CFAI, para passar de uma placa de células listradas para uma reação CFPS completa dentro de 24 horas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A supervisão dos pesquisadores é tradicionalmente necessária para duas ações-chave durante o crescimento celular: a indução de T7 RNAP e a colheita de células em um OD600 específico. O CFAI evita ambos os requisitos para diminuir o tempo e o treinamento técnico do pesquisador necessários para preparar extratos celulares de alta qualidade. A autoindução do T7 RNAP é obtida substituindo a glicose por lactose como o açúcar primário na mídia, evitando a necessidade anterior de monitorar ativament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer a Dra. Os autores também gostariam de agradecer a Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington e Jillian Kasman por discussões úteis. Os autores também reconhecem o apoio financeiro do Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly e national science foundation (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
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