Dalle cellule alla sintesi proteica senza cellule entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione senza cellule
Summary
Questo lavoro descrive la preparazione dell’estratto cellulare di Escherichia coli (E. coli) seguito da reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) in meno di 24 ore. La spiegazione del protocollo CFAI (Cell-Free Autoinduction) descrive i miglioramenti apportati per ridurre la supervisione dei ricercatori e aumentare le quantità di estratto cellulare ottenuto.
Abstract
La sintesi proteica senza cellule (CFPS) è cresciuta come piattaforma biotecnologica che cattura i macchinari di trascrizione e traduzione in vitro. Numerosi sviluppi hanno reso la piattaforma CFPS più accessibile ai nuovi utenti e hanno ampliato la gamma di applicazioni. Per i sistemi CFPS a base di lisato, gli estratti cellulari possono essere generati da una varietà di organismi, sfruttando la biochimica unica di quell’ospite per aumentare la sintesi proteica. Negli ultimi 20 anni, Escherichia coli (E. coli) è diventato uno degli organismi più utilizzati per sostenere la CFPS grazie alla sua convenienza e versatilità. Nonostante i numerosi progressi chiave, il flusso di lavoro per la preparazione dell’estratto di cellule di E. coli è rimasto un collo di bottiglia chiave per i nuovi utenti per implementare CFPS per le loro applicazioni. Il flusso di lavoro di preparazione dell’estratto richiede molto tempo e richiede competenze tecniche per ottenere risultati riproducibili. Per superare queste barriere, abbiamo precedentemente segnalato lo sviluppo di un flusso di lavoro CFAI (Cell-Free Autoinduction) 24 ore su 24 che riduce l’input dell’utente e le competenze tecniche richieste. Il flusso di lavoro CFAI riduce al minimo il lavoro e le competenze tecniche necessarie per generare estratti di cellule, aumentando al contempo le quantità totali di estratti cellulari ottenuti. Qui descriviamo quel flusso di lavoro in modo graduale per migliorare l’accesso e supportare l’ampia implementazione della CFPS basata su E. coli .
Introduction
L’uso della sintesi proteica senza cellule (CFPS) per applicazioni biotecnologiche è cresciuto notevolmente negli ultimi anni 1,2,3. Questo sviluppo può essere attribuito in parte a maggiori sforzi nella comprensione dei processi che si verificano nelle CFPS e del ruolo di ciascun componente 4,5. Inoltre, i costi ridotti attribuiti a configurazioni ottimizzate e fonti di energia alternative hanno reso la tecnologia senza celle più facile da implementare per i nuovi utenti 6,7,8,9. Al fine di implementare i fattori di trascrizione e traduzione necessari per la sintesi proteica, l’estratto cellulare viene spesso utilizzato per guidare le reazioni prive di cellule10. Le guide per l’utente pubblicate di recente hanno fornito protocolli semplici per la produzione di estratti funzionali, rendendo più facile l’implementazione per gli utenti nuovi ed esperti 1,11,12,13,14. L’estratto cellulare è solitamente ottenuto attraverso la lisi di una coltura cellulare, che può essere coltivata utilizzando diversi organismi a seconda dell’uso specifico desiderato 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) è diventato rapidamente uno degli organismi ospiti più comunemente utilizzati per la produzione di estratti funzionali17. Il ceppo BL21 Star (DE3) è preferito perché rimuove le proteasi dalla membrana esterna (proteasi OmpT) e dal citoplasma (proteasi Lon), fornendo un ambiente ottimale per l’espressione proteica ricombinante. Inoltre, il DE3 contiene il λDE3 che trasporta il gene per la T7 RNA polimerasi (T7 RNAP) sotto il controllo del promotore lacUV5; la componente stellare contiene un gene RNaseE mutato che impedisce la scissione dell’mRNA 4,14,18,19. Sotto il promotore lacUV5, l’induzione isopropil-tiogalattopiranoside (IPTG) consente l’espressione di T7 RNAP20,21. Questi ceppi sono usati per coltivare e raccogliere cellule, che danno materia prima per la preparazione dell’estratto. La lisi cellulare può essere eseguita utilizzando una varietà di metodi, tra cui il battito delle perline, la stampa francese, l’omogeneizzazione, la sonicazione e la cavitazione dell’azoto 1,11,12,22.
Il processo di coltura e raccolta batterica è coerente nella maggior parte delle piattaforme quando si utilizza E. coli, ma richiede più giorni e un’intensa supervisione del ricercatore 1,11,13. Questo processo inizia generalmente con una coltura di semi durante la notte in brodo LB, che dopo la crescita durante la notte viene poi inoculata in una coltura più ampia di 2xYTPG (lievito, triptone, tampone fosfato, glucosio) il giorno successivo. La crescita di questa coltura più grande viene monitorata fino a raggiungere la fase logaritmica dall’inizio alla metà, ad una densità ottica (OD) di 2,514,20. È necessaria una misurazione costante in quanto i componenti della trascrizione e della traduzione hanno precedentemente dimostrato di essere altamente attivi nella fase di log dall’inizio alla metà23,24. Mentre questo processo può creare estratto riproducibile, il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un nuovo metodo che utilizza Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, che riduce la supervisione dei ricercatori, aumenta la resa complessiva di estratto per un dato litro di coltura cellulare e migliora l’accesso alla preparazione dell’estratto a base di E. coli sia per gli utenti esperti che per quelli nuovi (Figura 1 ). Qui forniamo la guida passo-passo per l’implementazione del flusso di lavoro CFAI, per passare da una piastra striata di cellule a una reazione CFPS completata entro 24 ore.
Protocol
Representative Results
Discussion
La supervisione dei ricercatori è tradizionalmente necessaria per due azioni chiave durante la crescita cellulare: l’induzione di T7 RNAP e la raccolta di cellule a uno specifico OD600. CFAI ovvia a entrambi questi requisiti per ridurre il tempo del ricercatore e la formazione tecnica necessaria per preparare estratti cellulari di alta qualità. L’autoinduzione di T7 RNAP si ottiene sostituendo il glucosio con il lattosio come zucchero primario nel mezzo, ovviando alla precedente necessità di monitorare atti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Jennifer VanderKelen e Andrea Laubscher per il supporto tecnico. Gli autori desiderano anche ringraziare Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington e Jillian Kasman per le discussioni utili. Gli autori riconoscono anche il sostegno finanziario del Bill and Linda Frost Fund, del Center for Applications in Biotechnology’s Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, cal Poly Research, Scholarly e della National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
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