De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células
Summary
Este trabajo describe la preparación de extracto celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en menos de 24 horas. La explicación del protocolo de autoinducción libre de células (CFAI) detalla las mejoras realizadas para reducir la supervisión del investigador y aumentar las cantidades de extracto celular obtenido.
Abstract
La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) ha crecido como una plataforma biotecnológica que captura maquinaria de transcripción y traducción in vitro. Numerosos desarrollos han hecho que la plataforma CFPS sea más accesible para los nuevos usuarios y han ampliado la gama de aplicaciones. Para los sistemas CFPS basados en lisado, se pueden generar extractos celulares a partir de una variedad de organismos, aprovechando la bioquímica única de ese huésped para aumentar la síntesis de proteínas. En los últimos 20 años, Escherichia coli (E. coli) se ha convertido en uno de los organismos más utilizados para apoyar CFPS debido a su asequibilidad y versatilidad. A pesar de los numerosos avances clave, el flujo de trabajo para la preparación de extractos de células de E. coli ha seguido siendo un cuello de botella clave para que los nuevos usuarios implementen CFPS para sus aplicaciones. El flujo de trabajo de preparación de extractos requiere mucho tiempo y requiere experiencia técnica para lograr resultados reproducibles. Para superar estas barreras, anteriormente informamos sobre el desarrollo de un flujo de trabajo de autoinducción sin celdas (CFAI) las 24 horas que reduce la entrada del usuario y la experiencia técnica requerida. El flujo de trabajo de CFAI minimiza la mano de obra y la habilidad técnica requerida para generar extractos de células, al tiempo que aumenta las cantidades totales de extractos de células obtenidas. Aquí describimos ese flujo de trabajo paso a paso para mejorar el acceso y apoyar la amplia implementación de CFPS basado en E. coli .
Introduction
El uso de la síntesis de proteínas libres de células (PPCS) para aplicaciones biotecnológicas ha crecido sustancialmente en los últimos años 1,2,3. Este desarrollo puede atribuirse en parte al aumento de los esfuerzos para comprender los procesos que ocurren en CFPS y el papel de cada componente 4,5. Además, la reducción de los costos atribuidos a las configuraciones optimizadas y las fuentes de energía alternativas han hecho que la tecnología sin celdas sea más fácil de implementar para los nuevos usuarios 6,7,8,9. Con el fin de implementar los factores de transcripción y traducción necesarios para la síntesis de proteínas, el extracto celular se utiliza a menudo para impulsar reacciones libres de células10. Las guías de usuario publicadas recientemente han proporcionado protocolos simples para producir extracto funcional, lo que facilita la implementación para usuarios nuevos y experimentados por igual 1,11,12,13,14. El extracto celular se suele obtener a través de la lisis de un cultivo celular, que se puede cultivar utilizando diferentes organismos dependiendo del uso específico deseado 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) se ha convertido rápidamente en uno de los organismos huésped más utilizados para producir extractos funcionales17. Se prefiere la cepa BL21 Star (DE3) porque elimina las proteasas de la membrana externa (proteasa OmpT) y el citoplasma (Proteasa lon), proporcionando un ambiente óptimo para la expresión de proteínas recombinantes. Además, el DE3 contiene el λDE3 que lleva el gen de la ARN polimerasa T7 (T7 RNAP) bajo el control del promotor lacUV5; el componente estrella contiene un gen RNasaE mutado que evita la escisión del ARNm 4,14,18,19. Bajo el promotor lacUV5, la inducción isopropil-tiogalactopiraside (IPTG) permite la expresión de T7 RNAP 20,21. Estas cepas se utilizan para cultivar y cosechar células, que dan materia prima para la preparación del extracto. La lisis celular se puede realizar utilizando una variedad de métodos, incluyendo el batido de perlas, la prensa francesa, la homogeneización, la sonicación y la cavitación de nitrógeno 1,11,12,22.
El proceso de cultivo y recolección de bacterias es consistente en la mayoría de las plataformas cuando se usa E. coli, pero requiere varios días y una intensa supervisión del investigador 1,11,13. Este proceso generalmente comienza con un cultivo de semillas durante la noche en caldo LB, que al crecer durante la noche se inocula en un cultivo más grande de 2xYTPG (levadura, triptona, tampón de fosfato, glucosa) al día siguiente. El crecimiento de este cultivo más grande se monitorea hasta que alcanza la fase logarítmica temprana a media, a una densidad óptica (OD) de 2.514,20. Se requiere una medición constante ya que se ha demostrado previamente que los componentes de la transcripción y la traducción son altamente activos en la fase logarítmica temprana a media23,24. Si bien este proceso puede crear extracto reproducible, nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un nuevo método utilizando medios de autoinducción libre de células (CFAI), que reduce la supervisión del investigador, aumenta el rendimiento general del extracto para un litro determinado de cultivo celular y mejora el acceso a la preparación de extractos basados en E. coli tanto para usuarios experimentados como nuevos (Figura 1 ). Aquí proporcionamos la guía paso a paso para implementar el flujo de trabajo de CFAI, para pasar de una placa rayada de células a una reacción CFPS completa dentro de las 24 horas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La supervisión del investigador es tradicionalmente necesaria para dos acciones clave durante el crecimiento celular: la inducción de RNAP T7 y la recolección de células en un OD600 específico. CFAI evita ambos requisitos para disminuir el tiempo del investigador y la capacitación técnica requerida para preparar extractos celulares de alta calidad. La autoinducción de T7 RNAP se logra reemplazando la glucosa con lactosa como azúcar primaria en el medio, obviando la necesidad previa de monitorear activ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jennifer VanderKelen y Andrea Laubscher por su apoyo técnico. Los autores también desean agradecer a Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington y Jillian Kasman por sus útiles discusiones. Los autores también reconocen el apoyo financiero del Fondo Bill y Linda Frost, la Subvención de Dotación de Investigación Aplicada de Chevron Biotechnology del Centro de Aplicaciones en Biotecnología, Cal Poly Research, Scholarly y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
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