Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow
Summary
Dit werk beschrijft de bereiding van celextract van Escherichia coli (E. coli) gevolgd door celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in minder dan 24 uur. Uitleg van het celvrije auto-inductie (CFAI) protocol beschrijft verbeteringen die zijn aangebracht om het toezicht van onderzoekers te verminderen en de verkregen hoeveelheden celextract te verhogen.
Abstract
Celvrije eiwitsynthese (CFPS) is uitgegroeid tot een biotechnologisch platform dat transcriptie- en vertaalmachines in vitro vastlegt. Talrijke ontwikkelingen hebben het CFPS-platform toegankelijker gemaakt voor nieuwe gebruikers en hebben het scala aan toepassingen uitgebreid. Voor op lysaat gebaseerde CFPS-systemen kunnen celextracten worden gegenereerd uit een verscheidenheid aan organismen, waarbij de unieke biochemie van die gastheer wordt gebruikt om de eiwitsynthese te vergroten. In de afgelopen 20 jaar is Escherichia coli (E. coli) een van de meest gebruikte organismen geworden voor het ondersteunen van CFPS vanwege de betaalbaarheid en veelzijdigheid. Ondanks tal van belangrijke ontwikkelingen is de workflow voor de bereiding van E. coli-celextract een belangrijk knelpunt gebleven voor nieuwe gebruikers om CFPS voor hun toepassingen te implementeren. De workflow voor de voorbereiding van extracten is tijdrovend en vereist technische expertise om reproduceerbare resultaten te bereiken. Om deze barrières te overwinnen, meldden we eerder de ontwikkeling van een 24-uurs celvrije auto-inductie (CFAI) -workflow die de input van gebruikers en de vereiste technische expertise vermindert. De CFAI-workflow minimaliseert de arbeid en technische vaardigheden die nodig zijn om celextracten te genereren en verhoogt tegelijkertijd de totale hoeveelheden verkregen celextracten. Hier beschrijven we die workflow stap voor stap om de toegang te verbeteren en de brede implementatie van op E. coli gebaseerde CFPS te ondersteunen.
Introduction
Het gebruik van celvrije eiwitsynthese (CFPS) voor biotechnologische toepassingen is de afgelopen jaren aanzienlijk toegenomen 1,2,3. Deze ontwikkeling kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de toegenomen inspanningen om de processen die zich voordoen in CFPS en de rol van elk onderdeelte begrijpen 4,5. Bovendien hebben lagere kosten als gevolg van geoptimaliseerde opstellingen en alternatieve energiebronnen celvrije technologie gemakkelijker te implementeren gemaakt voor nieuwe gebruikers 6,7,8,9. Om de noodzakelijke transcriptie- en translatiefactoren voor eiwitsynthese te implementeren, wordt celextract vaak gebruikt om celvrije reactiesaan te sturen 10. Onlangs gepubliceerde gebruikershandleidingen hebben eenvoudige protocollen voor het produceren van functioneel extract, waardoor het gemakkelijker te implementeren is voor zowel nieuwe als ervaren gebruikers 1,11,12,13,14. Celextract wordt meestal verkregen door de lysis van een celkweek, die kan worden gekweekt met behulp van verschillende organismen, afhankelijk van het specifieke gebruik dat gewenst is 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) is snel uitgegroeid tot een van de meest gebruikte gastheerorganismen voor de productie van functionele extracten17. De BL21 Star (DE3) stam heeft de voorkeur omdat het de proteasen uit het buitenmembraan (OmpT protease) en het cytoplasma (Lon protease) verwijdert, waardoor een optimale omgeving wordt geboden voor de recombinante eiwitexpressie. Bovendien bevat de DE3 het λDE3 dat het gen voor T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) draagt onder controle van de lacUV5-promotor; de stercomponent bevat een gemuteerd RNaseE-gen dat splitsing van mRNA 4,14,18,19 voorkomt. Onder de lacUV5-promotor maakt isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie de expressie van T7 RNAP20,21 mogelijk. Deze stammen worden gebruikt om cellen te kweken en te oogsten, die grondstof geven voor de bereiding van extracten. Cellyse kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, waaronder kralen kloppen, Franse pers, homogenisatie, ultrasoonapparaat en stikstof cavitatie 1,11,12,22.
Het proces van bacteriekweek en oogsten is consistent op de meeste platforms bij het gebruik van E. coli, maar vereist meerdere dagen en intensief toezicht van de onderzoeker 1,11,13. Dit proces begint over het algemeen met een nachtelijke zaadkweek in LB-bouillon, die bij nachtelijke groei vervolgens wordt ingeënt tot een grotere cultuur van 2xYTPG (gist, trypton, fosfaatbuffer, glucose) de volgende dag. De groei van deze grotere cultuur wordt gemonitord totdat deze de vroege tot midden logfase bereikt, bij een optische dichtheid (OD) van 2,514,20. Constante meting is vereist omdat eerder is aangetoond dat de componenten van transcriptie en translatie zeer actief zijn in de vroege tot midden logfase23,24. Hoewel dit proces reproduceerbare extracten kan creëren, heeft ons laboratorium onlangs een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, die het toezicht van onderzoekers vermindert, de totale opbrengst van extract voor een bepaalde liter celkweek verhoogt en de toegang tot E. coli-gebaseerde extractbereiding voor zowel ervaren als nieuwe gebruikers verbetert (figuur 1 ). Hier bieden we de stapsgewijze handleiding voor het implementeren van de CFAI-workflow, om binnen 24 uur van een gestreepte plaat cellen naar een voltooide CFPS-reactie te gaan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toezicht door onderzoekers is traditioneel nodig voor twee belangrijke acties tijdens celgroei: de inductie van T7 RNAP en het oogsten van cellen bij een specifieke OD600. CFAI voorkomt beide vereisten om de tijd van de onderzoeker te verminderen en de technische training die nodig is om celextracten van hoge kwaliteit te bereiden. Auto-inductie van T7 RNAP wordt bereikt door glucose te vervangen door lactose als de primaire suiker in de media, waardoor de eerdere noodzaak om de groei actief te controleren en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs willen Dr. Jennifer VanderKelen en Andrea Laubscher bedanken voor technische ondersteuning. Auteurs willen ook Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington en Jillian Kasman bedanken voor de nuttige discussies. Auteurs erkennen ook de financieringssteun van het Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology’s Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly en de National Science Foundation (NSF-1708919).
Materials
| 1.5 mL Microfuge Tubes | Phenix | MPC-425Q | |
| 1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
| Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT5F | |
| D-Glucose | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactose | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| L-Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa Aesar | A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Acros, Organics | A0382124 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Acros, Organics | A0379904 | |
| PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Baffled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 |
References
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
- Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
- Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
- Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
- Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
- Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
- Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
- Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
- Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
- Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
- Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
- Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
- Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
- Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
- Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
- Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
- Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).
