Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.
Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) is de voorkeursmethode geworden voor het onderzoeken van cellulaire ultrastructuur en moleculaire complexen in hun oorspronkelijke, bevroren-gehydrateerde toestand. Cryo-ET vereist echter dat monsters dun genoeg zijn om de invallende elektronenbundel niet te verstrooien of te blokkeren. Voor dikke cellulaire monsters kan dit worden bereikt door cryo-gerichte ionenbundel (FIB) frezen. Dit protocol beschrijft hoe specifieke cellulaire locaties tijdens FIB-frezen kunnen worden gericht met behulp van een 3D-correlatieve benadering, die driedimensionale fluorescentiemicroscopiegegevens combineert met informatie van de FIB-scannende elektronenmicroscoop. Met behulp van deze techniek kunnen zeldzame cellulaire gebeurtenissen en structuren met hoge nauwkeurigheid worden gericht en gevisualiseerd op moleculaire resolutie met behulp van cryo-transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM).
Gefocusseerd ionenbundelfrezen maakt de bereiding van dunne biologische monsters van cryo-gefixeerde monsters mogelijk zonder de problemen die gewoonlijk gepaard gaan met mechanische secties zoals mesmarkeringen en compressieartefacten1. In combinatie met cryo-elektronentomografie maakt FIB-frezen biologische studies met hoge resolutie van de cellulaire morfologie en bepaling van de structuur van macromoleculaire complexen rechtstreeks vanuit cellen mogelijk met subnanometerresolutie 2,3,4. Hoewel overvloedige soorten, zoals ribosomen, gemakkelijk worden gevonden in willekeurig gesneden FIB-lamellen, zijn veel cellulaire processen afhankelijk van de colokalisatie van verschillende complexen of zijn ze gelokaliseerd op specifieke plaatsen in de cel. Bijgevolg is efficiënte targeting vereist om het biologische kenmerk van belang tijdens het freesproces niet te verliezen en beperkt te blijven tot willekeurige treffers. Een correlatieve benadering die gegevens van de scanning elektronenmicroscoop (SEM)-FIB en een cryo-fluorescentielichtmicroscoop (FLM) combineert, is daarom noodzakelijk. Hoewel het mogelijk is om de initiële correlatie weg te laten en FLM- en cryo-ET-gegevens pas na TEM-acquisitie5,6 te combineren, maakt fluorescentiegeleid gericht ionenbundelfrezen een nauwkeurige selectie van het freesgebied vooraf mogelijk, wat resulteert in een efficiëntere gegevensverzameling. Sinds de conceptie7 was de toepassing van 3D-gecorreleerd FIB-frezen in biologische studies beperkt totdat we onlangs meldden dat we met behulp van deze techniek een nieuw vloeibaar-vloeibaar fasegescheiden (LLPS) compartiment in gist identificeerden8.
Hier wordt een gegeneraliseerd 3D cryo-gecorreleerd licht- en elektronenmicroscopieprotocol (CLEM) beschreven, dat kan worden gebruikt om een breed scala aan monsters te bestuderen, variërend van bacteriën tot gist- en zoogdiercellen. Hoewel de experimenten werden uitgevoerd met behulp van een bepaalde set instrumenten, zijn de afzonderlijke stappen niet gebonden aan specifieke hardware en kunnen ze gemakkelijk worden overgedragen naar andere systemen als een uitbreiding op bestaande protocollen 3,5. Een lijst met geteste apparatuur en voorgestelde instellingen vindt u in de materiaaltabel en tabel 1. De vier belangrijkste stappen van de pijplijn zijn (1) monstervoorbereiding, (2) lokalisatie van interessante kenmerken door cryofluorescentiemicroscopie, (3) 3D-gecorreleerd gefocusseerd ionenbundelfrezen en (4) lokalisatie van de beoogde structuren voor cryo-ET-gegevensverzameling op de lamellen in de cryotransmissie-elektronenmicroscoop (figuur 1).
1. Kritieke stappen in het protocol
Optimalisatie van celcultuur en grid plunging parameters is fundamenteel voor deze workflow. Aan het begin van een project is het de moeite waard om tijd te investeren in het optimaliseren van taggingstrategieën, de verdeling van cellen en fiduciale kralen, en het testen van verschillende rastervoorbereiding en blottingparameters. Het werken met een optimaal ondergevroren monster zal de downstream-verwerking aanzienlijk vergemakkelijken.
Zoals voor elk TEM-experiment zijn glasvochtmonsters vereist. Voor grote zoogdiercellen zoals HeLa hebben 1-2 cellen per rastervierkant de voorkeur, maar cellen kunnen nog steeds glasachtig zijn bij een hogere dichtheid. Optioneel kan vitrificatie worden verbeterd in zoogdiercellen (bijv. HEK293, HeLa) door ze te incuberen met 2,5-10% (v / v) glycerol toegevoegd aan het kweekmedium 10 minuten voordat23 wordt gedompeld. Indien beschikbaar, kunnen rasterpatronen worden gebruikt om een perfecte plaatsing en verdeling van de cellen te garanderen, waardoor de vitrificatie en latere correlatieworden verbeterd 24.
Hoewel specifieke cellen tijdens de workflow kunnen worden geselecteerd, zullen te weinig cellen die het biologische kenmerk van belang vertonen, de totale doorvoer aanzienlijk verminderen. Om de correlatie in POI-positieve cellen te verbeteren, moeten voldoende heldere fluoroforen worden gebruikt. Dit is vooral belangrijk op endogene expressieniveaus. We ontdekten dat mVenus onder cryo-omstandigheden vaak beter presteerde dan EGFP vanwege de verhoogde helderheid25 en de hypsochrome verschuiving, waardoor het geschikt blijft voor standaard GFP-filteropstellingen onder cryo-omstandigheden26. Voor niet-puntachtige doelstructuren moet ook de afweging tussen golflengte en lokalisatienauwkeurigheid (Abbe-diffractielimiet) worden overwogen.
Efficiënte 3D-correlatie vereist ook dat rasters mechanisch stabiel zijn en met grote zorg worden behandeld. Hoewel standaard gouden of koperen roosters met koolstofondersteuning kunnen worden gebruikt, kan het slagingspercentage aanzienlijk worden verhoogd door meer rigide SiO2-films te gebruiken, afhankelijk van het project. Het is echter nog niet definitief vastgesteld of (a) mechanische stabiliteit of (b) het matchen van thermische uitzettingscoëfficiënten (substraat versus film) om cryo-rimpelingte verminderen 27, de meest cruciale factor is voor succesvolle 3D-correlatie. Bovendien kunnen voor het oppakken van fragiele Au-roosters met polydimethylsiloxaan gecoate schalen worden gebruikt5.
Naast het waarborgen van de stabiliteit van het monster, is een zorgvuldige keuze van FLM-beeldvormingsparameters noodzakelijk voor het verkrijgen van hoogwaardige fluorescentiestapels die geschikt zijn voor optimale targeting tijdens het FIB-frezen. In dit verband wordt ook geadviseerd om verschillende denoising28 – of deconvolutietechnieken op de FLM-gegevens te testen, omdat dit de lokalisatie van fiducialen en cellulaire signalen aanzienlijk kan verbeteren. Bij het correleren van het fluorescentiesignaal met FIB-SEM-beelden is een goede bemonstering van fiduciale kralen belangrijk. Ze moeten goed verdeeld zijn over de cellen en eventueel op verschillende z-hoogtes. Het is ook een goede gewoonte om de consistentie van de correlatie te valideren door de voorspelde versus werkelijke posities van kralen te controleren die opzettelijk buiten het fiduciale model zijn gelaten, maar duidelijk met het oog kunnen worden gecorreleerd. De RMSE-waarden van 3DCT moeten ook altijd in overweging worden genomen om de consistentie van de registratie te controleren.
Aangezien de afzetting van gefreesd materiaal en restwater uit de FIB-SEM-kamer (d.w.z. herbesmetting) de effectieve lamellendikte verhoogt door amorf materiaal aan beide zijden ervan toe te voegen, vermindert het langdurig in de microscoop houden van fijngemalen lamellen over het algemeen de TEM-gegevenskwaliteit als gevolg van extra elektronenverstrooiingsgebeurtenissen. Dienovereenkomstig wordt frezen meestal in twee stappen uitgevoerd: eerst worden alle posities ruw gefreesd (d.w.z. tot ongeveer 800 nm) en vervolgens fijn (tot ~ 150-250 nm) en wordt het rooster onmiddellijk gelost nadat de laatste lamellen zijn voltooid. Een beter correlatiesucces kan echter worden bereikt door de posities van belang op een locatiegewijze manier te verwerken, waardoor ruw en fijn frezen op dezelfde lamellen direct na elkaar wordt uitgevoerd, omdat dit geen tijd overlaat voor buigen of vervorming. Dit vermindert echter het maximale aantal lamellen dat per rooster kan worden geproduceerd, afhankelijk van de herbesmettingssnelheid van het systeem. Voor een snelheid van 20 nm / h worden 4-6 lamellen geproduceerd binnen 1-1,5 uur.
Beweging van het gehele rooster of de ruw gefreesde lamellen >300 nm zal resulteren in een slechte of mislukte correlatie (zie ook de hieronder besproken beperkingen). Het moet daarom regelmatig worden gecontroleerd, bijvoorbeeld door IB-beelden te vergelijken voor, tijdens en na het FIB-frezen. Locaties die een significante beweging vertonen (>300 nm) moeten worden weggegooid. Optimaliseer de monstervoorbereiding (d.w.z. keuze van rastertype, celdichtheid en kelderparameters; zie protocolsectie 1) en freesstrategie om deze bewegingen te voorkomen. Lamellenbuiging kan aanzienlijk worden verminderd door plaatselijk te frezen zoals beschreven in stap 3.6 en de lamellenbreedte te verkleinen. Zoals eerder vermeld, terwijl stressverlichtingssneden15 zijn ontworpen om het buigen van lamellen te verminderen, resulteren ze vaak in een gecoördineerde beweging van de ontkoppelde lamellen, waardoor correlatie effectief wordt voorkomen. Geïntegreerde FLM-systemen kunnen worden gebruikt om dit probleem op te lossen.
2. Wijzigingen en problemen met de methode
Het wordt ten zeerste aanbevolen om een grondige karakterisering van het monster uit te voeren in live-cell imaging voordat u naar cryo-omstandigheden gaat. Het optimaliseren van de cellulaire monsters, behandelingsschema’s en weten wat voor soort signaal te verwachten voordat de cryo-workflow wordt betreden, kan het slagingspercentage aanzienlijk verbeteren.
In de hier gepresenteerde workflow wordt een stand-alone fluorescentiemicroscoop met een cryotrap gebruikt om de monsters in beeld te brengen, gevolgd door een overdracht van de rasters naar de gefocusseerde ionenbundelmicroscoop. Het is echter getest op systemen waarbij een fluorescentiemicroscoop is geïntegreerd in de FIB-SEM-kamer en daarom is er geen monsteroverdracht vereist om fluorescentiebeeldente verkrijgen 29,30,31. Met behulp van dergelijke geïntegreerde systemen kunnen interessante posities tijdens en na het FIB-frezen in beeld worden gebracht om te controleren op de aanwezigheid van het doelfluorescentiesignaal zonder het risico op verontreiniging van de uiteindelijke lamellen te vergroten. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de optische parameters van de gebruikte microscopen, omdat bijvoorbeeld een laag NA-objectief de precisie beperkt waarmee fiduciale kralen en doelsignalen kunnen worden gelokaliseerd. Niettemin zullen geïntegreerde FLM-opstellingen helpen om ook beter om te gaan met lichte vervormingen van rasters en lamellen, omdat FLM-stacks voortdurend kunnen worden bijgewerkt en vergeleken met up-to-date SEM- en IB-weergaven.
Als alternatief voor fluorescentiebeeldvorming van de lamellen tussen FIB-frezen en TEM-gegevensverzameling, kan post-TEM-correlatie worden gebruikt om de juiste plaatsing en frezen van de lamellente verifiëren 5,6.
Tijdens alle stappen van de correlatieve workflow, maar vooral tijdens TEM, wordt aanbevolen om een overlay te maken van de geprojecteerde fluorescentiegegevens op de FIB-SEM/TEM-afbeeldingen. Dergelijke klassieke CLEM-weergaven helpen om intuïtiever te begrijpen welk deel van de cellen zich in de lamellen bevindt. Dit dient ook als een nuttige sanity check om de nauwkeurigheid van de correlatie te verifiëren.
3. Beperkingen van de methode
De 3D-correlatieve FIB-benadering vereist monsters die kunnen worden geleverd met fiduciale kralen. Dienovereenkomstig is deze methode momenteel beperkt tot diepgevroren roosters. Voor hogedruk (HPF) bevroren (weefsel) monsters kunnen momenteel alleen 2D-2D-correlaties worden uitgevoerd. Mogelijk kunnen interne fiduciale markers (bijv. organellen, gekleurde lipidedruppels) een oplossing zijn voor dit probleem32,33. Het uiteindelijke succespercentage van de correlatie hangt af van vele factoren, waaronder de kwaliteit van het monster, de fluorescentiemicroscopie-opstelling, de lamellendikte en de grootte van de beoogde structuur. De correlatienauwkeurigheid met behulp van de beschreven 3D-registratiebenadering wordt geschat op 200-300 nm op het uiteindelijke IB-beeld, ruwweg overeenkomend met de typische dikte van FIB-gefreesde lamellen7. Dienovereenkomstig zullen cellulaire structuren die veel kleiner zijn dan dit op dit moment moeilijk te richten zijn. Bovendien vermindert overmatige beweging op de freeslocatie (> 300 nm) ook de nauwkeurigheid van de correlatie, een probleem dat mogelijk kan worden aangepakt met FLM-opstellingen die zijn geïntegreerd in FIB / SEM-instrumenten. Lamellen die tijdens het frezen een sterke vervorming of buiging vertonen, moeten in ieder geval van de stroomafwaartse workflow worden uitgesloten.
Over het algemeen wordt cryofluorescentiebeeldvorming momenteel beperkt door het Abbe-diffractiecriterium. Met meer routinematige toepassing (en commercialisering) van super-opgeloste cryo-FLM-methoden, zou een nauwkeuriger targeting van cellulaire structuren mogelijk kunnen worden, vooral wanneer geïntegreerd in de FIB / SEM voor on-the-fly operatie.
4. Betekenis van de methode
Vooral in vergelijking met niet-gerichte en post-correlatietechnieken, maakt de 3D-gecorreleerde FIB-freesbenadering de selectie van geschikte posities mogelijk vóór de tijd- en resource-verslindende TEM-stap. Het maakt daardoor efficiëntere gegevensverzameling en projectplanning mogelijk. Bovendien voegen de gecorreleerde fluorescentiegegevens een laag informatie toe die cruciaal kan zijn voor het interpreteren van de tomogrammen en voor het integreren van de cryo-ET-resultaten in projecten op meerdere schalen, vooral wanneer het gaat om niet-gestructureerde eiwitassemblages of die te klein zijn voor sjabloonmatching en subtomogrammiddeling.
5. Belang en mogelijke toekomstige toepassingen
In combinatie met geavanceerde workflows zoals cryo-lift uit HPF-monsters 34,35, cryo-FIB-SEM volume 36 en superresolutiefluorescentiebeeldvorming26,37,38,39, biedt 3D-gerichte lamellenvoorbereiding het vooruitzicht om niet alleen biologische processen in geïsoleerde cellen te ontleden, maar ook om weefsel- en patiëntmonsters toegankelijk te maken voor FIB-frezen en cryo-elektronentomografie. Als zodanig zal het dissectie van pathologische processen met hoge resolutie mogelijk maken en dus een integrale bouwsteen zijn voor een biopsie op nanoschaal.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Inga Wolf voor het ondersteunen van de IT-infrastructuur, Florian Beck voor computationele ondersteuning en Oda H. Schiøtz voor het kritisch lezen van het manuscript. De financiering werd gedeeltelijk verstrekt door middel van een Alexander von Humboldt returners fellowship aan Philipp S. Erdmann en een EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 aan Florian Wilfling. Anna Bieber werd ondersteund door een Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. fellowship.
Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |