Nous présentons ici un pipeline pour le fraisage par faisceau d’ions focalisés corrélatifs 3D sur le guidage de la préparation d’échantillons cellulaires pour la cryo-tomographie électronique. La position 3D des protéines d’intérêt marquées par fluorescence est d’abord déterminée par cryo-microscopie à fluorescence, puis ciblée pour le broyage. Le protocole convient aux cellules de mammifères, de levures et de bactéries.
La cryotomographie électronique (cryo-ET) est devenue la méthode de choix pour étudier l’ultrastructure cellulaire et les complexes moléculaires dans leur état natif congelé-hydraté. Cependant, la cryo-ET exige que les échantillons soient suffisamment minces pour ne pas disperser ou bloquer le faisceau d’électrons incidents. Pour les échantillons à cellules épaisses, cela peut être réalisé par broyage par faisceau d’ions cryofocalisés (FIB). Ce protocole décrit comment cibler des sites cellulaires spécifiques pendant le broyage FIB à l’aide d’une approche corrélative 3D, qui combine des données de microscopie à fluorescence tridimensionnelle avec des informations provenant du microscope électronique à balayage FIB. Grâce à cette technique, des événements et des structures cellulaires rares peuvent être ciblés avec une grande précision et visualisés à une résolution moléculaire à l’aide de la cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET).
Le fraisage par faisceau d’ions focalisé permet la préparation d’échantillons biologiques minces à partir d’échantillons cryofixés sans les problèmes généralement associés aux coupes mécaniques telles que les marques de couteau et les artefacts de compression1. Lorsqu’il est associé à la cryotomographie électronique, le broyage FIB permet des études biologiques à haute résolution de la morphologie cellulaire et la détermination de la structure des complexes macromoléculaires directement à l’intérieur des cellules à une résolution sub-nanométrique 2,3,4. Alors que des espèces abondantes, telles que les ribosomes, se trouvent facilement dans les lamelles FIB coupées au hasard, de nombreux processus cellulaires reposent sur la colocalisation de plusieurs complexes ou sont localisés à des sites spécifiques dans la cellule. Par conséquent, un ciblage efficace est nécessaire pour ne pas perdre la caractéristique biologique d’intérêt pendant le processus de broyage et être limité à des coups aléatoires. Une approche corrélative combinant les données du microscope électronique à balayage (MEB)-FIB et d’un microscope optique à cryofluorescence (FLM) est donc nécessaire. Bien qu’il soit possible d’omettre la corrélation initiale et de combiner les données FLM et cryo-ET uniquement après l’acquisition TEM5,6, le fraisage par faisceau d’ions focalisé guidé par fluorescence permet une sélection précise de la zone de fraisage au préalable, ce qui se traduit par une acquisition de données plus efficace. Depuis sa conception7, l’application du broyage FIB corrélé 3D dans les études biologiques avait été limitée jusqu’à ce que nous rapportions récemment l’identification d’un nouveau compartiment à séparation de phase liquide-liquide (LLPS) chez la levure à l’aide de cette technique8.
Nous décrivons ici un protocole de microscopie optique et électronique 3D corrélée (CLEM) généralisée, qui peut être utilisé pour étudier une grande variété d’échantillons allant des bactéries aux cellules de levure et de mammifères. Bien que les expériences aient été réalisées à l’aide d’un certain ensemble d’instruments, les différentes étapes ne sont pas liées à un matériel spécifique et peuvent facilement être transférées à d’autres systèmes en tant qu’extension des protocoles existants 3,5. Une liste de l’équipement testé et des réglages suggérés sont fournis dans le tableau des matériaux et le tableau 1. Les quatre étapes clés de la chaîne sont (1) la préparation des échantillons, (2) la localisation des caractéristiques d’intérêt par cryo-microscopie à fluorescence, (3) le fraisage par faisceau d’ions focalisés corrélé en 3D, et (4) la localisation des structures ciblées pour l’acquisition de données cryo-ET sur les lamelles dans le microscope électronique à cryo-transmission (Figure 1).
1. Étapes critiques du protocole
L’optimisation des paramètres de culture cellulaire et de plongement de la grille est fondamentale pour ce flux de travail. Au début d’un projet, il vaut la peine d’investir du temps pour optimiser les stratégies de marquage, la distribution des cellules et des billes de repère, et tester différents paramètres de préparation de grille et de buvard. Travailler avec un échantillon congelé en plongée de manière optimale facilitera considérablement le traitement en aval.
Comme pour toute expérience TEM, des échantillons de vitré sont nécessaires. Pour les grandes cellules de mammifères telles que HeLa, 1 à 2 cellules par carré de grille sont préférables, mais les cellules peuvent encore être vitrées à une densité plus élevée. En option, la vitrification peut être améliorée dans les cellules de mammifères (par exemple, HEK293, HeLa) en les incubant avec 2,5 à 10 % (v/v) de glycérol ajouté au milieu de culture 10 min avant de plonger23. S’il est disponible, la mise en forme de grille peut être utilisée pour assurer un placement et une distribution parfaits des cellules, améliorant ainsi la vitrification et la corrélation ultérieure24.
Bien que des cellules spécifiques puissent être sélectionnées au cours du flux de travail, trop peu de cellules présentant la caractéristique biologique d’intérêt réduiront considérablement le débit global. Pour améliorer la corrélation dans les cellules POI positives, il convient d’utiliser des fluorophores suffisamment brillants. Ceci est particulièrement important au niveau de l’expression endogène. Nous avons constaté que dans des conditions cryogéniques, mVenus fonctionnait souvent mieux que l’EGFP en raison de sa luminosité accrue25 et du décalage hypsochrome, ce qui le maintient adapté aux configurations de filtres GFP standard dans des conditions cryogéniques26. Pour les structures cibles non ponctuelles, le compromis entre la longueur d’onde et la précision de localisation (limite de diffraction d’Abbe) doit également être pris en compte.
Une corrélation 3D efficace exige également que les grilles soient mécaniquement stables et manipulées avec le plus grand soin. Bien que des grilles standard en or ou en cuivre avec support en carbone puissent être utilisées, le taux de réussite peut être considérablement augmenté en utilisant des films SiO2 plus rigides en fonction du projet. Cependant, il n’a pas encore été déterminé de manière concluante si (a) la stabilité mécanique ou (b) l’adaptation des coefficients de dilatation thermique (substrat vs film) pour réduire le froissement cryogénique27, est le facteur le plus crucial pour une corrélation 3D réussie. De plus, pour ramasser les grilles d’or fragiles, des boîtes revêtues de polydiméthylsiloxane peuvent être utilisées5.
En plus d’assurer la stabilité de l’échantillon, un choix minutieux des paramètres d’imagerie FLM est nécessaire pour obtenir des empilements de fluorescence de haute qualité adaptés à un ciblage optimal lors du broyage FIB. À cet égard, il est également conseillé de tester différentes techniques de débruitage28 ou de déconvolution sur les données FLM, car cela peut améliorer considérablement la localisation des repères et des signaux cellulaires. Lors de la corrélation du signal de fluorescence avec des images FIB-SEM, un bon échantillonnage des billes de repère est important. Ils doivent être bien répartis autour des cellules et éventuellement à différentes hauteurs z. Il est également recommandé de valider la cohérence de la corrélation en vérifiant les positions prédites par rapport aux positions réelles des billes qui ont été délibérément exclues du modèle de repère, mais qui peuvent clairement être corrélées à l’œil nu. Les valeurs RMSE de 3DCT doivent également toujours être prises en compte pour vérifier la cohérence de l’enregistrement.
Étant donné que le dépôt de matériau broyé et d’eau résiduelle de la chambre FIB-SEM (c’est-à-dire la recontamination) augmente l’épaisseur effective des lamelles en ajoutant un matériau amorphe des deux côtés de celle-ci, le fait de conserver des lamelles finement broyées dans le microscope pendant une période prolongée réduit généralement la qualité des données TEM en raison d’événements supplémentaires de diffusion d’électrons. En conséquence, le fraisage est le plus souvent effectué en deux étapes : d’abord, toutes les positions sont fraisées grossièrement (c’est-à-dire à environ 800 nm), puis finement (à ~150-250 nm), et la grille est immédiatement déchargée après la fin de la dernière lamelle. Il est toutefois possible d’obtenir un meilleur succès de corrélation en traitant les positions d’intérêt de manière ponctuelle, ce qui permet d’effectuer un fraisage grossier et fin sur la même lamelle directement l’une après l’autre, car cela ne laisse pas de temps pour la flexion ou la déformation. Cependant, cela réduit le nombre maximum de lamelles pouvant être produites par grille en fonction du taux de recontamination du système. Pour une vitesse de 20 nm/h, 4 à 6 lamelles sont produites en 1 à 1,5 h.
Le mouvement de l’ensemble de la grille ou des lamelles grossièrement fraisées >300 nm entraînera une corrélation médiocre ou infructueuse (voir également les limitations discutées ci-dessous). Il doit donc être vérifié régulièrement, par exemple en comparant les images IB avant, pendant et après le fraisage FIB. Les sites qui présentent un mouvement important (>300 nm) doivent être éliminés. Optimiser la préparation de l’échantillon (c’est-à-dire le choix du type de grille, de la densité cellulaire et des paramètres de plongée ; voir la section 1 du protocole) et la stratégie de broyage pour éviter ces mouvements. La flexion des lamelles peut être considérablement réduite par le fraisage par site comme décrit à l’étape 3.6 et la réduction de la largeur des lamelles. Comme mentionné précédemment, bien que les coupes de soulagement des contraintes15 aient été conçues pour réduire la flexion des lamelles, elles entraînent souvent un mouvement concerté de la lamelle découplée, empêchant ainsi efficacement la corrélation. Des systèmes FLM intégrés peuvent être utilisés pour résoudre ce problème.
2. Modifications et dépannage de la méthode
Il est fortement conseillé d’effectuer une caractérisation approfondie de l’échantillon en imagerie de cellules vivantes avant de passer aux cryo-conditions. L’optimisation des échantillons cellulaires, des schémas de traitement et le fait de savoir à quel type de signal s’attendre avant d’entrer dans le flux de travail cryogénique peuvent améliorer considérablement son taux de réussite.
Dans le flux de travail présenté ici, un microscope à fluorescence autonome avec une platine cryogénique est utilisé pour imager les échantillons, suivi d’un transfert des grilles dans le microscope à faisceau d’ions focalisé. Cependant, il a été testé sur des systèmes où un microscope à fluorescence est intégré dans la chambre FIB-SEM, et donc aucun transfert d’échantillon n’est nécessaire pour acquérir des images de fluorescence 29,30,31. À l’aide de tels systèmes intégrés, les positions d’intérêt peuvent être imagées pendant et après le fraisage FIB pour vérifier la présence du signal de fluorescence cible sans augmenter le risque de contamination des lamelles finales. Il est cependant important de garder à l’esprit les paramètres optiques des microscopes utilisés, car, par exemple, un objectif à faible NA limitera la précision avec laquelle les billes de repère et les signaux cibles peuvent être localisés. Néanmoins, les configurations FLM intégrées aideront également à mieux gérer les légères déformations des grilles et des lamelles, car les piles FLM peuvent être mises à jour en permanence et comparées aux vues MEB et IB les plus récentes.
Comme alternative à l’imagerie par fluorescence de la lamelle entre le fraisage FIB et l’acquisition de données TEM, la corrélation post-TEM peut être utilisée pour vérifier le placement et le fraisage corrects des lamelles 5,6.
Pendant toutes les étapes du flux de travail corrélatif, mais surtout pendant la MET, il est recommandé de créer une superposition des données de fluorescence projetées sur les images FIB-SEM/TEM. De telles vues CLEM classiques aident à comprendre plus intuitivement quelle partie des cellules est contenue dans les lamelles. Il s’agit également d’une vérification utile de l’intégrité pour vérifier l’exactitude de la corrélation.
3. Limites de la méthode
L’approche FIB corrélative 3D nécessite des échantillons qui peuvent être fournis avec des billes de repère. Par conséquent, cette méthode est actuellement limitée aux grilles de congélation en plongée. Pour les échantillons congelés (tissus) à haute pression (HPF), seules les corrélations 2D-2D peuvent actuellement être effectuées. Potentiellement, les marqueurs de repère internes (par exemple, les organites, les gouttelettes lipidiques colorées) pourraient être une solution à ce problème32,33. Le taux de réussite de la corrélation finale dépend de nombreux facteurs, notamment la qualité de l’échantillon, la configuration de la microscopie à fluorescence, l’épaisseur des lamelles et la taille de la structure ciblée. La précision de corrélation à l’aide de l’approche de recalage 3D décrite est estimée à une plage de 200 à 300 nm sur l’image finale de l’IB, ce qui correspond à peu près à l’épaisseur typique des lamelles fraisées FIB7. En conséquence, les structures cellulaires beaucoup plus petites que cela seront difficiles à cibler à l’heure actuelle. De plus, un mouvement excessif sur le site de fraisage (>300 nm) réduit également la précision de la corrélation, un problème qui peut potentiellement être résolu avec des configurations FLM intégrées dans les instruments FIB/SEM. Les lamelles qui présentent une forte déformation ou flexion pendant le fraisage doivent, dans tous les cas, être exclues du flux de travail en aval.
Dans l’ensemble, l’imagerie par cryofluorescence est actuellement limitée par le critère de diffraction d’Abbe. Avec une application (et une commercialisation) plus systématiques des méthodes cryo-FLM super-résolues, un ciblage plus précis des structures cellulaires pourrait devenir possible, en particulier lorsqu’elles sont intégrées dans le FIB/SEM pour un fonctionnement à la volée.
4. Importance de la méthode
En particulier par rapport aux techniques non ciblées et post-corrélation, l’approche de fraisage FIB corrélée en 3D permet de sélectionner les positions appropriées avant l’étape TEM qui prend beaucoup de temps et de ressources. Cela permet une collecte de données et une planification de projet plus efficaces. De plus, les données de fluorescence corrélées ajoutent une couche d’informations qui peuvent être cruciales pour l’interprétation des tomogrammes et pour l’intégration des résultats cryo-ET dans les projets multi-échelles, en particulier lorsqu’il s’agit d’assemblages de protéines non structurées ou trop petits pour l’appariement de modèles et la moyenne des sous-tomogrammes.
5. Importance et applications futures potentielles
En combinaison avec des flux de travail avancés tels que la cryo-extraction d’échantillons HPF 34,35, le volume cryo-FIB-SEM 36 et l’imagerie par fluorescence à super-résolution26,37,38,39, la préparation lamellaire ciblée en 3D offre la perspective non seulement de disséquer les processus biologiques dans des cellules isolées, mais aussi de rendre les échantillons de tissus et de patients accessibles au broyage FIB et à la cryotomographie électronique. En tant que tel, il permettra de disséquer les processus pathologiques à haute résolution et constituera ainsi un élément intégral d’une biopsie à l’échelle nanométrique.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Inga Wolf pour son soutien à l’infrastructure informatique, Florian Beck pour son soutien informatique et Oda H. Schiøtz pour la lecture critique du manuscrit. Le financement a été fourni en partie par le biais d’une bourse Alexander von Humboldt à Philipp S. Erdmann et d’une bourse à long terme ALTF 764-2014 de l’EMBO à Florian Wilfling. Anna Bieber a bénéficié d’une bourse de doctorat du Fonds Boehringer Ingelheim.
Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |