यहां, हम क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सेलुलर नमूनों की तैयारी का मार्गदर्शन करने पर 3 डी-कोररिलेटिव केंद्रित आयन बीम मिलिंग के लिए एक पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं। रुचि के फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की 3 डी स्थिति पहले क्रायो-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित की जाती है, और फिर मिलिंग के लिए लक्षित होती है। प्रोटोकॉल स्तनधारी, खमीर और जीवाणु कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है।
क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) अपने मूल, जमे हुए-हाइड्रेटेड अवस्था में सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर और आणविक परिसरों की जांच के लिए पसंद की विधि बन गई है। हालांकि, क्रायो-ईटी के लिए आवश्यक है कि नमूने इतने पतले हों कि घटना इलेक्ट्रॉन बीम को बिखेरया या अवरुद्ध न करें। मोटे सेलुलर नमूनों के लिए, यह क्रायो-केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) मिलिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि 3 डी-कोररिलेटिव दृष्टिकोण का उपयोग करके एफआईबी मिलिंग के दौरान विशिष्ट सेलुलर साइटों को कैसे लक्षित किया जाए, जो एफआईबी-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से जानकारी के साथ तीन-आयामी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी डेटा को जोड़ता है। इस तकनीक का उपयोग करके, दुर्लभ सेलुलर घटनाओं और संरचनाओं को उच्च सटीकता के साथ लक्षित किया जा सकता है और क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-टीईएम) का उपयोग करके आणविक संकल्प पर कल्पना की जा सकती है।
केंद्रित आयन बीम मिलिंग आमतौर पर यांत्रिक सेक्शनिंग जैसे चाकू के निशान और संपीड़न कलाकृतियों से जुड़ी समस्याओं के बिना क्रायो-फिक्स्ड नमूनों से पतले जैविक नमूने तैयार करने की अनुमतिदेता है। जब क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के साथ जोड़ा जाता है, तो एफआईबी मिलिंग सेलुलर आकृति विज्ञान के उच्च-रिज़ॉल्यूशन जैविक अध्ययन और उप-नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन 2,3,4 पर कोशिकाओं के भीतर से सीधे मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचना का निर्धारण करने में सक्षम बनाता है। जबकि प्रचुर मात्रा में प्रजातियां, जैसे राइबोसोम, यादृच्छिक रूप से काटे गए एफआईबी लैमेला में आसानी से पाई जाती हैं, कई सेलुलर प्रक्रियाएं कई परिसरों के सह-स्थानीयकरण पर निर्भर करती हैं या सेल के भीतर विशिष्ट साइटों के लिए स्थानीयकृत होती हैं। नतीजतन, मिलिंग प्रक्रिया के दौरान रुचि की जैविक विशेषता को न खोने और यादृच्छिक हिट तक सीमित होने के लिए कुशल लक्ष्यीकरण की आवश्यकता होती है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) -एफआईबी और क्रायो-फ्लोरेसेंस लाइट माइक्रोस्कोप (एफएलएम) से डेटा को जोड़ने वाला एक सहसंबंधित दृष्टिकोण इसलिए आवश्यक है। जबकि प्रारंभिक सहसंबंध को छोड़ना और टीईएम अधिग्रहण5,6 के बाद ही एफएलएम और क्रायो-ईटी डेटा को संयोजित करना संभव है, प्रतिदीप्ति-निर्देशित केंद्रित आयन बीम मिलिंग पहले से मिलिंग क्षेत्र का सटीक चयन करने में सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक कुशल डेटा अधिग्रहण होता है। इसकी अवधारणा7 के बाद से, जैविक अध्ययनों में 3 डी-सहसंबद्ध एफआईबी मिलिंग का आवेदन तब तक सीमित था जब तक कि हमने हाल ही मेंइस तकनीक का उपयोग करके खमीर में एक नए तरल-तरल चरण-अलग (एलएलपीएस) डिब्बे की पहचान नहीं की।
यहां वर्णित एक सामान्यीकृत 3 डी क्रायो-सहसंबद्ध प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सीएलईएम) प्रोटोकॉल है, जिसका उपयोग बैक्टीरिया से लेकर खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं तक के नमूनों की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि प्रयोगों को उपकरणों के एक निश्चित सेट का उपयोग करके किया गया था, व्यक्तिगत चरण विशिष्ट हार्डवेयर से बंधे नहीं हैं और आसानी से मौजूदा प्रोटोकॉल 3,5 के विस्तार के रूप में अन्य प्रणालियों में स्थानांतरित किए जा सकते हैं। परीक्षण किए गए उपकरणों और सुझाई गई सेटिंग्स की एक सूची सामग्री की तालिका और तालिका 1 में प्रदान की जाती है। पाइपलाइन के चार प्रमुख चरण हैं (1) नमूना तैयारी, (2) क्रायो-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा रुचि की विशेषताओं का स्थानीयकरण, (3) 3 डी-सहसंबद्ध केंद्रित आयन बीम मिलिंग, और (4) क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में लैमेला पर क्रायो-ईटी डेटा अधिग्रहण के लिए लक्षित संरचनाओं का स्थानीयकरण (चित्रा 1)।
1. प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
सेल कल्चर और ग्रिड प्लंगिंग पैरामीटर का अनुकूलन इस वर्कफ़्लो के लिए मौलिक है। एक परियोजना की शुरुआत में, टैगिंग रणनीतियों, कोशिकाओं और भौतिक मोतियों के वितरण को अनुकूलित करने और विभिन्न ग्रिड तैयारी और ब्लोटिंग मापदंडों का परीक्षण करने के लिए समय का निवेश करना उचित है। एक बेहतर डुबकी-जमे हुए नमूने के साथ काम करने से डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण में काफी सुविधा होगी।
किसी भी टीईएम प्रयोग के लिए, विट्रस नमूने की आवश्यकता होती है। हेला जैसे बड़े स्तनधारी कोशिकाओं के लिए, प्रति ग्रिड वर्ग में 1-2 कोशिकाएं बेहतर होती हैं, लेकिन कोशिकाएं अभी भी उच्च घनत्व पर विट्रस हो सकती हैं। वैकल्पिक रूप से, स्तनधारी कोशिकाओं (जैसे, एचईके 293, हेला) में विट्रीफिकेशन में सुधार किया जा सकता है, उन्हें 23 गिरने से 10 मिनट पहले कल्चर माध्यम में 2.5-10% (वी / वी) ग्लिसरॉल के साथ जोड़ाजाता है। यदि उपलब्ध हो, तो ग्रिड पैटर्निंग का उपयोग कोशिकाओं के सही प्लेसमेंट और वितरण को सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है, जिससे विट्रीफिकेशन और बाद में सहसंबंधमें सुधार होता है।
जबकि वर्कफ़्लो के दौरान विशिष्ट कोशिकाओं का चयन किया जा सकता है, बहुत कम कोशिकाएं जो रुचि की जैविक विशेषता दिखाती हैं, समग्र थ्रूपुट को काफी कम कर देंगी। पीओआई-पॉजिटिव कोशिकाओं में सहसंबंध में सुधार करने के लिए, पर्याप्त उज्ज्वल फ्लोरोफोर का उपयोग किया जाना चाहिए। यह अंतर्जात अभिव्यक्ति स्तरों पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। हमने पाया कि क्रायो-स्थितियों के तहत, एमवीनस ने अक्सर अपनी बढ़ी हुई चमक25 और हाइप्सोक्रोमिक शिफ्ट के कारण ईजीएफपी से बेहतर प्रदर्शन किया, जो इसे क्रायो-कंडीशन26 के तहत मानक जीएफपी फिल्टर सेटअप के लिए उपयुक्त रखता है। गैर-बिंदु जैसी लक्ष्य संरचनाओं के लिए, तरंग दैर्ध्य और स्थानीयकरण सटीकता (अब्बे विवर्तन सीमा) के बीच व्यापार-बंद पर भी विचार किया जाना चाहिए।
कुशल 3 डी-सहसंबंध के लिए यह भी आवश्यक है कि ग्रिड यांत्रिक रूप से स्थिर हों और उन्हें बहुत सावधानी से संभाला जाए। जबकि कार्बन समर्थन के साथ मानक सोने या तांबे के ग्रिड का उपयोग किया जा सकता है, परियोजना के आधार पर अधिक कठोर एसआईओ2 फिल्मों का उपयोग करके सफलता दर में काफी वृद्धि हो सकती है। हालांकि, यह अभी तक निर्णायक रूप से निर्धारित नहीं किया गया है कि (ए) यांत्रिक स्थिरता या (बी) क्रायो-रिंकलिंग27 को कम करने के लिए थर्मल विस्तार गुणांक (सब्सट्रेट बनाम फिल्म) का मिलान, सफल 3 डी सहसंबंध के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है। इसके अलावा, नाजुक एयू ग्रिड उठाने के लिए, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन-लेपितव्यंजनों का उपयोग किया जा सकता है।
नमूना स्थिरता सुनिश्चित करने के अलावा, उच्च गुणवत्ता वाले प्रतिदीप्ति ढेर प्राप्त करने के लिए एफएलएम इमेजिंग मापदंडों का सावधानीपूर्वक विकल्प आवश्यक है जो एफआईबी मिलिंग के दौरान इष्टतम लक्ष्यीकरण के लिए उपयुक्त हैं। इस संबंध में, एफएलएम डेटा पर विभिन्न डीनोइज़िंग28 या डीकॉन्वोल्यूशन तकनीकों का परीक्षण करने की भी सलाह दी जाती है, क्योंकि यह फिड्यूशियल ्स और सेलुलर संकेतों के स्थानीयकरण में काफी सुधार कर सकता है। फ्लोरेसेंस सिग्नल को एफआईबी-एसईएम छवियों से संबंधित करते समय, फिड्यूशियल मोतियों का एक अच्छा नमूना महत्वपूर्ण है। उन्हें कोशिकाओं के चारों ओर और संभवतः विभिन्न जेड ऊंचाइयों पर अच्छी तरह से वितरित किया जाना चाहिए। मोतियों की अनुमानित बनाम वास्तविक स्थितियों की जांच करके सहसंबंध की स्थिरता को मान्य करना भी अच्छा अभ्यास है जो जानबूझकर फिड्यूशियल मॉडल से बाहर छोड़ दिए गए थे, लेकिन स्पष्ट रूप से आंखों से सहसंबद्ध किया जा सकता है। पंजीकरण स्थिरता की जांच करने के लिए 3डीसीटी के आरएमएसई मूल्यों पर भी हमेशा विचार किया जाना चाहिए।
चूंकि एफआईबी-एसईएम कक्ष (यानी, पुन: संदूषण) से मिल्ड सामग्री और अवशिष्ट पानी का जमाव इसके दोनों किनारों पर अनाकार सामग्री जोड़कर प्रभावी लैमेला मोटाई को बढ़ाता है, माइक्रोस्कोप में लंबे समय तक बारीक-मिल्ड लैमेला रखने से आम तौर पर अतिरिक्त इलेक्ट्रॉन प्रकीर्णन घटनाओं के कारण टीईएम डेटा की गुणवत्ता कम हो जाती है। तदनुसार, मिलिंग अक्सर दो-चरणीय फैशन में की जाती है: सबसे पहले, सभी पदों को मोटे तौर पर (यानी, लगभग 800 एनएम तक) मिलाया जाता है, और फिर बारीक (~ 150-250 एनएम तक), और अंतिम लैमेला पूरा होने के तुरंत बाद ग्रिड को अनलोड किया जाता है। हालांकि, साइट-वार तरीके से रुचि के पदों को संसाधित करके बेहतर सहसंबंध सफलता प्राप्त की जा सकती है, इसलिए एक दूसरे के बाद सीधे एक ही लैमेला पर खुरदरी और ठीक मिलिंग करना क्योंकि इससे झुकने या विरूपण के लिए कोई समय नहीं बचता है। यह, हालांकि, सिस्टम की पुन: संदूषण दर के आधार पर प्रति ग्रिड उत्पादित किए जा सकने वाले लैमेला की अधिकतम संख्या को कम करता है। 20 एनएम / घंटा की दर के लिए, 1-1.5 घंटे के भीतर 4-6 लैमेला का उत्पादन किया जाता है।
पूरे ग्रिड या रफ-मिल्ड लैमेला >300 एनएम के आंदोलन के परिणामस्वरूप खराब या असफल सहसंबंध होगा (नीचे चर्चा की गई सीमाएं भी देखें)। इसलिए इसे नियमित रूप से जांचना चाहिए, उदाहरण के लिए, एफआईबी मिलिंग से पहले, दौरान और बाद में आईबी छवियों की तुलना करके। महत्वपूर्ण आंदोलन (>300 एनएम) दिखाने वाली साइटों को छोड़ दिया जाना चाहिए। इन आंदोलनों से बचने के लिए नमूना तैयारी (यानी, ग्रिड प्रकार, सेल घनत्व और प्लंगिंग मापदंडों की पसंद; प्रोटोकॉल अनुभाग 1 देखें) और मिलिंग रणनीति का अनुकूलन करें। चरण 3.6 में वर्णित साइट-वार मिलिंग और लैमेला चौड़ाई को कम करके लैमेला झुकने को काफी कम किया जा सकता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, जबकि तनाव राहत कटौती15 को लैमेला झुकने को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, वे अक्सर डी-युग्मित लैमेला के एक ठोस आंदोलन के परिणामस्वरूप होते हैं, जिससे सहसंबंध को प्रभावी ढंग से रोका जा सकता है। इस समस्या को हल करने के लिए एकीकृत FLM सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है।
2. विधि के संशोधन और समस्या
क्रायो-स्थितियों में जाने से पहले लाइव-सेल इमेजिंग में नमूने का संपूर्ण लक्षण वर्णन करने की अत्यधिक सलाह दी जाती है। सेलुलर नमूनों, उपचार योजनाओं को अनुकूलित करना, और यह जानना कि क्रायो-वर्कफ़्लो में प्रवेश करने से पहले किस तरह के संकेत की उम्मीद की जाती है, इसकी सफलता दर में काफी सुधार हो सकता है।
यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो में, क्रायो-स्टेज के साथ एक स्टैंड-अलोन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग नमूनों की छवि बनाने के लिए किया जाता है, इसके बाद ग्रिड को केंद्रित आयन बीम माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित किया जाता है। हालांकि, यह उन प्रणालियों पर परीक्षण किया गया है जहां एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप एफआईबी-एसईएम कक्ष में एकीकृत है, और इसलिए प्रतिदीप्ति छवियों 29,30,31 को प्राप्त करने के लिए कोई नमूना हस्तांतरण की आवश्यकता नहीं है। इस तरह के एकीकृत प्रणालियों का उपयोग करके, अंतिम लैमेला को दूषित करने के जोखिम को बढ़ाए बिना लक्ष्य प्रतिदीप्ति संकेत की उपस्थिति की जांच करने के लिए एफआईबी मिलिंग के दौरान और बाद में रुचि की स्थिति को चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल मापदंडों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, एक कम एनए उद्देश्य उस परिशुद्धता को सीमित करेगा जिसके साथ भौतिक मोती और लक्ष्य संकेतों को स्थानीयकृत किया जा सकता है। बहरहाल, एकीकृत एफएलएम सेटअप ग्रिड और लैमेला के मामूली विकृतियों से बेहतर ढंग से निपटने में मदद करेंगे, क्योंकि एफएलएम स्टैक को लगातार अपडेट किया जा सकता है और अप-टू-डेट एसईएम और आईबी दृश्यों की तुलना की जा सकती है।
एफआईबी मिलिंग और टीईएम डेटा अधिग्रहण के बीच लैमेला की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के विकल्प के रूप में, पोस्ट-टीईएम सहसंबंध का उपयोग लैमेला 5,6 के सही प्लेसमेंट और मिलिंग को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है।
सहसंबंधित वर्कफ़्लो के सभी चरणों के दौरान, लेकिन विशेष रूप से टीईएम के दौरान, एफआईबी-एसईएम / टीईएम छवियों पर अनुमानित प्रतिदीप्ति डेटा का ओवरले बनाने की सिफारिश की जाती है। इस तरह के शास्त्रीय सीएलईएम दृश्य अधिक सहजता से समझने में मदद करते हैं कि कोशिकाओं का कौन सा हिस्सा लैमेला के भीतर निहित है। यह सहसंबंध की सटीकता को सत्यापित करने के लिए एक उपयोगी पवित्रता जांच के रूप में भी कार्य करता है।
3. विधि की सीमाएं
3 डी-कोररिलेटिव एफआईबी दृष्टिकोण के लिए उन नमूनों की आवश्यकता होती है जिन्हें फिड्यूशियल बीड्स के साथ आपूर्ति की जा सकती है। तदनुसार, यह विधि वर्तमान में डुबकी-जमे हुए ग्रिड तक ही सीमित है। उच्च दबाव (एचपीएफ) जमे हुए (ऊतक) नमूनों के लिए, वर्तमान में, केवल 2 डी -2 डी सहसंबंध किए जा सकते हैं। संभावित रूप से, आंतरिक फिड्यूशियल मार्कर (जैसे, ऑर्गेनेल, सना हुआ लिपिड बूंदें)इस समस्या का समाधान हो सकता है। अंतिम सहसंबंध सफलता दर कई कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें नमूना गुणवत्ता, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेटअप, लैमेला मोटाई और लक्षित संरचना का आकार शामिल है। वर्णित 3 डी पंजीकरण दृष्टिकोण का उपयोग करके सहसंबंध सटीकता अंतिम आईबी छवि पर 200-300 एनएम की सीमा में होने का अनुमान है, जो मोटे तौर पर एफआईबी-मिल्ड लैमेला7 की विशिष्ट मोटाई के अनुरूप है। तदनुसार, इससे बहुत छोटी सेलुलर संरचनाओं को वर्तमान में लक्षित करना मुश्किल होगा। इसके अतिरिक्त, मिलिंग साइट (>300 एनएम) पर अत्यधिक आंदोलन भी सहसंबंध की सटीकता को कम करता है, एक मुद्दा जिसे संभावित रूप से एफआईबी / एसईएम उपकरणों में एकीकृत एफएलएम सेटअप के साथ संबोधित किया जा सकता है। मिलिंग के दौरान मजबूत विरूपण या झुकने वाले लैमेला को किसी भी मामले में, डाउनस्ट्रीम वर्कफ़्लो से बाहर रखा जाना चाहिए।
कुल मिलाकर, क्रायो-फ्लोरेसेंस इमेजिंग वर्तमान में अब्बे विवर्तन मानदंड द्वारा सीमित है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-एफएलएम विधियों के अधिक नियमित अनुप्रयोग (और व्यावसायीकरण) के साथ, सेलुलर संरचनाओं का अधिक सटीक लक्ष्यीकरण संभव हो सकता है, खासकर जब ऑन-द-फ्लाई ऑपरेशन के लिए एफआईबी / एसईएम में एकीकृत किया जाता है।
4. विधि का महत्व
विशेष रूप से गैर-लक्षित और पोस्ट-सहसंबंध तकनीकों की तुलना में, 3 डी-सहसंबद्ध एफआईबी मिलिंग दृष्टिकोण समय और संसाधन लेने वाले टीईएम चरण से पहले उपयुक्त पदों के चयन की अनुमति देता है। यह, इस प्रकार, अधिक कुशल डेटा संग्रह और परियोजना योजना को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, सहसंबद्ध प्रतिदीप्ति डेटा जानकारी की एक परत जोड़ता है जो टोमोग्राम की व्याख्या करने और बहु-स्तरीय परियोजनाओं में क्रायो-ईटी परिणामों को एकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, खासकर जब गैर-संरचित प्रोटीन असेंबली से निपटते हैं या टेम्पलेट मिलान और सबटोमोग्राम औसत के लिए बहुत छोटे होते हैं।
5. महत्व और संभावित भविष्य के अनुप्रयोग
उन्नत वर्कफ़्लोज़ जैसे कि एचपीएफ नमूनों से क्रायो-लिफ्टआउट 34,35, क्रायो-एफआईबी-एसईएम वॉल्यूम 36 और सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग26,37,38,39 के संयोजन में, 3 डी-लक्षित लैमेला तैयारी न केवल पृथक कोशिकाओं में जैविक प्रक्रियाओं को विच्छेदित करने की संभावना प्रदान करती है, बल्कि ऊतक और रोगी के नमूनों को एफआईबी मिलिंग और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सुलभ बनाने की संभावना भी प्रदान करती है। जैसे, यह उच्च रिज़ॉल्यूशन पर पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं के विच्छेदन की अनुमति देगा और इस प्रकार नैनोस्केल में बायोप्सी की ओर एक अभिन्न बिल्डिंग ब्लॉक होगा।
The authors have nothing to disclose.
हम आईटी बुनियादी ढांचे का समर्थन करने के लिए इंगा वुल्फ, कम्प्यूटेशनल समर्थन के लिए फ्लोरियन बेक और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ओडा एच। फिलिप एस एर्डमैन को अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट रिटर्नर्स फैलोशिप और फ्लोरियन विल्लिंग को ईएमबीओ लॉन्ग-टर्म फैलोशिप एएलटीएफ 764-2014 के माध्यम से धन प्रदान किया गया था। अन्ना बीबर को बोहरिंगर इंगेलहेम फोंड्स पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |