Summary
Hier beschrieben ist ein detailliertes Protokoll zur Durchführung eines mitochondrialen Stresstests und eines Glykolytika-Rate-Assays in ex vivo Netzhautgewebeproben unter Verwendung eines kommerziellen Bioanalytikers.
Abstract
Die mitochondriale Atmung ist ein kritischer energieerzeugender Weg in allen Zellen, insbesondere in retinalen Photorezeptoren, die einen hochaktiven Stoffwechsel besitzen. Darüber hinaus weisen Photorezeptoren auch eine hohe aerobe Glykolyse wie Krebszellen auf. Präzise Messungen dieser Stoffwechselaktivitäten können wertvolle Einblicke in die zelluläre Homöostase unter physiologischen Bedingungen und in Krankheitszuständen liefern. Hochdurchsatz-Mikroplatten-basierte Assays wurden entwickelt, um die mitochondriale Atmung und verschiedene Stoffwechselaktivitäten in lebenden Zellen zu messen. Ein Großteil davon wird jedoch für kultivierte Zellen entwickelt und ist nicht für intakte Gewebeproben und für die Anwendung ex vivo optimiert. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll unter Verwendung der Mikroplatten-basierten Fluoreszenztechnologie beschrieben, um die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Indikator für die mitochondriale Atmung sowie die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) als Indikator für die Glykolyse in intaktem Ex-vivo-Netzhautgewebe direkt zu messen. Diese Methode wurde verwendet, um die Stoffwechselaktivitäten in der Netzhaut der erwachsenen Maus erfolgreich zu bewerten und ihre Anwendung bei der Untersuchung zellulärer Mechanismen des Alterns und der Krankheit zu demonstrieren.
Introduction
Mitochondrien sind essentielle Organellen, die den Zellstoffwechsel, die Signalübertragung, die Homöostase und die Apoptose regulieren, indem sie mehrere entscheidende physiologische Prozesse koordinieren1. Mitochondrien dienen als Kraftpaket in der Zelle, um Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) zu erzeugen und Energie bereitzustellen, die fast alle zellulären Ereignisse unterstützt. Der Großteil des zellulären Sauerstoffs wird in Mitochondrien metabolisiert, wo er während der aeroben Atmung als letzter Elektronenakzeptor in der Elektronentransportkette (ETC) dient. Geringe Mengen an ATP können auch aus der Glykolyse im Zytosol hergestellt werden, wo Glukose in Pyruvat umgewandelt wird, das weiter in Laktat umgewandelt oder in Mitochondrien transportiert und zu Acetyl-CoA, einem Substrat im Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus), oxidiert werden kann.
Die Netzhaut ist eines der metabolisch aktivsten Gewebe bei Säugetieren2 und weist eine hohe mitochondriale Atmung und einen extrem hohen Sauerstoffverbrauch auf3. Die Stäbchen- und Zapfenphotorezeptoren enthalten eine hohe Dichte an Mitochondrien4, und OXPHOS erzeugt das meiste ATP in der Netzhaut5. Darüber hinaus stützt sich die Netzhaut auch stark auf die aerobe Glykolyse6,7, indem sie Glukose in Laktat umwandelt5. Mitochondriale Defekte sind mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert8,9; und mit ihrem einzigartigen hohen Energiebedarf ist die Netzhaut besonders anfällig für Stoffwechseldefekte, einschließlich solcher, die mitochondriales OXPHOS4 und Glykolyse10 betreffen. Mitochondriale Dysfunktion und Defekte in der Glykolyse sind an degenerativen Erkrankungen der Netzhaut11,12 und Makula 13, altersbedingter Makuladegeneration10,14,15,16 und diabetischer Retinopathie 17,18 beteiligt. Daher können genaue Messungen der mitochondrialen Atmung und Glykolyse wichtige Parameter für die Beurteilung der Integrität und Gesundheit der Netzhaut liefern.
Die mitochondriale Atmung kann durch die Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gemessen werden. Da die Umwandlung von Glukose in Pyruvat und anschließend in Laktat zur Extrusion von Protonen in die extrazelluläre Umgebung und zur Versauerung der extrazellulären Umgebung führt, liefern Messungen der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) einen Hinweis auf den Glykolysefluss. Da die Netzhaut aus mehreren Zelltypen mit intimen Beziehungen und aktiver Synergie besteht, einschließlich des Austauschs von Substraten6, ist es unerlässlich, die mitochondriale Funktion und den Stoffwechsel im Kontext des gesamten Netzhautgewebes mit intakter Laminierung und Schaltkreise zu analysieren. In den letzten Jahrzehnten wurden die Clark-O2-Elektroden und andere Sauerstoffmikroelektroden verwendet, um den Sauerstoffverbrauch in der Netzhaut zu messen19,20,21. Diese Sauerstoffelektroden haben große Einschränkungen in der Empfindlichkeit, die Anforderung eines großen Probenvolumens und die Notwendigkeit eines kontinuierlichen Rührens der suspendierenden Probe, was normalerweise zur Störung des Zell- und Gewebekontexts führt. Das hier beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung einer Mikroplatten-basierten Fluoreszenztechnik entwickelt, um den mitochondrialen Energiestoffwechsel in frisch seziertem Ex-vivo-Netzhautgewebe der Maus zu messen. Es ermöglicht Echtzeitmessungen von OCR und ECAR im mittleren Durchsatz gleichzeitig mit einer kleinen Probe (1 mm Stempel) von Ex-vivo-Netzhautgewebe, wobei die Notwendigkeit einer Suspension und eines kontinuierlichen Rührens vermieden wird.
Demonstriert wird hier das experimentelle Verfahren für den mitochondrialen Stresstest und den glykolytischen Geschwindigkeitstest auf frisch sezierten netztinalen Stanzscheiben. Dieses Protokoll ermöglicht die Messung von mitochondrienbedingten Stoffwechselaktivitäten in einem ex vivo Gewebekontext. Im Gegensatz zu den Assays, die mit kultivierten Zellen durchgeführt werden, spiegeln die hier erhaltenen Messwerte den kombinierten Energiestoffwechsel auf Gewebeebene wider und werden durch Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb des Gewebes beeinflusst. Das Protokoll wurde gegenüber einer zuvor veröffentlichten Version22,23 modifiziert, um es an die neue Generation des Agilent Seahorse Extracellular Flux 24-Wells (XFe24) Analysators mit Islet Capture Platte anzupassen. Das Assay-Medium, die Konzentrationen der Injektionsverbindungen und die Anzahl/Dauer der Assay-Zyklen wurden ebenfalls für das Netzhautgewebe optimiert. Für die Herstellung von netztinalen Lochscheiben wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll gegeben. Weitere Informationen zum Programmaufbau und zur Datenanalyse finden Sie im Benutzerhandbuch des Herstellers24,25,26.
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Protocol
Alle Mausprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des National Eye Institute (NEI ASP# 650) genehmigt. Die Mäuse wurden unter 12-stündigen Hell-Dunkel-Bedingungen untergebracht und nach den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren, des Instituts für Labortierressourcen und der Politik des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren versorgt.
1. Hydratisierende Sensorkartusche und Vorbereitung des Assay-Mediums
- Geben Sie am Tag vor dem Experiment 1 ml des Kalibriermediums zu jeder Vertiefung der Versorgungsplatte hinzu. Legen Sie die Hydro-Booster-Abdeckung auf die Oberseite und senken Sie die Sensorpatrone durch die Öffnung auf der Abdeckung. Stellen Sie sicher, dass der Sensor in das Kalibriermedium eingetaucht ist. Inkubieren Sie die Sensorkartusche über Nacht in einem CO2-freien Inkubator bei 37 °C, um die Fluorophore zu aktivieren.
HINWEIS: Um eine Verdunstung zu verhindern, wird der Inkubator befeuchtet, indem eine Schale mit Wasser darin aufbewahrt wird, und die Sensorkassette ist mit durchsichtiger Plastikfolie umwickelt. - Bereiten Sie das Assay-Medium vor, indem Sie das Seahorse DMEM-Medium unter Zugabe von Glucose, Pyruvat und Glutamin zu den gewünschten Konzentrationen rekonstituieren. In den in diesem Artikel berichteten Assays beträgt die Endkonzentration der Substrate im Assay-Medium: 6 mM Glucose, 0,12 mM Pyruvat und 0,5 mM Glutamin. Für jede Assay-Platte werden 40 ml des Assay-Mediums frisch am Tag des Experiments hergestellt.
- Richten Sie das Assay-Programm im Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers ein26. In dem hier gezeigten Assay wird das Protokoll wie folgt festgelegt: 5 Messzyklen für die Baseline, dann Injektion von Port A, gefolgt von 4 Messzyklen, dann Injektion von Port B und gefolgt von 4 Messzyklen. Jeder Zyklus setzt sich aus Mix (3 min), Wait (2 min) und Measure (3 min) zusammen.
2. Beschichtung von Mesh-Einsätzen von Insel-Capture-Mikrotiterplatten
- Bereiten Sie die Beschichtungsmischung vor, indem Sie 20 μL des Zellanhangsmediums (z. B. Cell-Tak) mit 171 μL 0,1 M Natriumbicarbonat und 9 μL 1 M NaOH kombinieren.
- Öffnen Sie den Deckel der Kassette mit den Netzeinsätzen. 8 μL der Beschichtungsmischung auf jedes Netz einstreuen. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um das Tröpfchen vorsichtig zu verschmieren / zu verteilen, um die Beschichtungsmischung gleichmäßig über den Netzeinsatz zu verteilen.
- Schließen Sie die Kassette und lassen Sie die Netzeinsätze bei Raumtemperatur für mindestens 25 min zur Adsorption inkubieren.
- Waschen Sie den Netzeinsatz, indem Sie 4 ml des Assay-Mediums direkt auf die Netzeinsätze pipettieren. Schütteln Sie die Kassette vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Netzeinsätze mit dem Assay-Medium gewaschen werden.
- Halten Sie den Netzeinsatz beiseite. Es ist gebrauchsfertig.
3. Herstellung von Injektionsverbindungen
- Vorratsaliquots aus Bam15 (10 mM), Rotenon (10 mM), Antimycin A (10 mM) und 2-DG (500 mM) aus -80 °C gefrieren und bei Raumtemperatur auftauen.
HINWEIS: Der 2-DG-Bestand ist gebrauchsfertig. Die anderen Medikamente müssen zu Arbeitsmaterial verdünnt werden. - Erwärmen Sie 10 ml des Assay-Mediums in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Verdünnen Sie 10 mM Bam15-Material auf 50 μM Arbeitsmaterial mit einem zweistufigen Verdünnungsverfahren: Mischen Sie 20 μL 10 mM-Material mit 20 μL DMSO, um 5 mM Zwischenmaterial zu erhalten. Mischen Sie dann 10 μL des oben genannten 5 mM Zwischenmaterials mit 990 μL vorgewärmtem Assay-Medium, um das endgültige 50 μM-Arbeitsmaterial zu erhalten.
- Verdünnen und kombinieren Sie 10 mM Rotenon und 10 mM Antimycin A-Kern zu 10 μM Rotenon / Antimycin A (Rot / AA) Arbeitsstoff durch zwei Verdünnungsschritte: Mischen Sie jeweils 10 μL aus 10 mM Rotenon und 10 mM Antimycin A-Stamm mit 80 μL DMSO, um 1 mM Rot / AA-Zwischenmaterial zu erhalten. Mischen Sie dann 10 μL des oben genannten 1 mM Zwischenmaterials mit 990 μL vorgewärmtem Assay-Medium, um das endgültige 10 μM Rot/AA-Arbeitsmaterial zu erhalten.
- Bereiten Sie die oben genannten Arbeitsvorräte an Injektionsverbindungen am Tag des Experiments frisch vor und legen Sie sie bei Raumtemperatur beiseite, bis sie in die Injektionsöffnungen der Sensorpatrone geladen werden.
4. Netzhautdissektion und Netzhautstanzvorbereitung
- Eine Maus durch CO2-Ersticken gemäß den AVMA-Richtlinien zur Euthanasie einschläfern27.
HINWEIS: Lassen Sie das Tier nicht länger als die für die Euthanasie benötigte Zeit in einer CO2-Kammer . - Augen enukleieren und in eisalten 1x PBS-Puffer in eine Petrischale geben und dann unter ein Seziermikroskop legen.
- Entfernen Sie vorsichtig, indem Sie mit Mikroscheren schneiden, die zusätzlichen Rektusmuskeln, die außerhalb des Augapfels befestigt sind, und schneiden Sie den Sehnerv ab.
- Verwenden Sie eine 30 G Nadel, um ein Loch am Rand der Hornhaut (Limbus) zu stanzen; dies dient als Einführstelle für die Mikroscheren. Verwenden Sie dann eine feine Dissektionsmikroschere, um einen kreisförmigen Schnitt entlang des Hornhautrandes zu machen und ihn von der hinteren Augenmuschel zu trennen.
- Verwenden Sie eine scharfe Dissektionszange, um die Hornhaut, die Linse und den Glaskörper von der Augenmuschel zu entfernen.
- Verwenden Sie feine Dissektionsmikroscheren, um mehrere kleine Schnitte an der Skleralschicht am Rand der Augenmuschel vorzunehmen. Vermeiden Sie es, die Netzhautschicht zu schneiden. Verwenden Sie zwei scharfe Dissektionszangen, um das Sklerusgewebe auf jeder Seite des Schnitts festzuhalten, und ziehen Sie sehr vorsichtig an der Skleralschicht, um sie von der neuralen Netzhaut zu entfernen. Wiederholen Sie dies um die Augenmuschel, bis alle Sklera entfernt ist und eine intakte Netzhautschale erhalten wird.
- Verwenden Sie Dissektionsmikroscheren und machen Sie radiale Schnitte an der Netzhautschale, um sie abzuflachen und mehrere unterschiedliche Abschnitte zu erzeugen.
HINWEIS: Abhängig von den Sezierfähigkeiten und der Erfahrung der Person im Umgang mit frischem Netzhautgewebe kann der Netzhautbecher geschnitten werden, um 3 bis 5 verschiedene Abschnitte zu erzeugen. - Verwenden Sie einen Biopsie-Puncher mit einem Durchmesser von 1 mm, um eine Netzhautscheibe aus jedem Abschnitt des abgeflachten Netzhautbechers zu schneiden.
HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass die Netzhautscheiben in gleichem Abstand vom Sehnervenkopf gestanzt werden. - Verwenden Sie eine Pinzette, um die vorbeschichteten Netzeinsätze in die sezierende Petrischale zu geben. Legen Sie mit Hilfe von zwei superfeinen Wimpernbürsten die netzhaute Stempelscheibe auf den Netzeinsatz. Die netztinale Stanzscheibe wird in der Mitte des Netzeinsatzes platziert, wobei die Ganglienzellschicht auf der Seite nach unten das Netz berührt und die Photorezeptorschicht nach oben zeigt.
HINWEIS: Häufig bleiben einige RPE-Zellen an den Photorezeptoren gebunden, und die Pigmentierung dieser Zellen kann als Indikator für die Ausrichtung der retinalen Stanzscheibe verwendet werden.
5. Einlegen der Einspritzöffnungen der Sensorkassette und Kalibrierung
- Nehmen Sie die hydratisierte Sensorkassette aus dem 37 °C-Inkubator. Entfernen Sie die Abdeckung des Hydro-Boosters und legen Sie die Sensorkassette wieder auf die Versorgungsplatte.
- Laden Sie das gewünschte Volumen an Injektionscompound-Arbeitsstofflösungen in die entsprechenden Ports. Halten Sie die Pipettenspitze im 45 ° Winkel. Führen Sie die Pipettenspitze halbwegs in einen Injektionsanschluss mit der Fase der Spitze gegen die gegenüberliegende Wand des Injektionsanschlusses ein und laden Sie die Mischung vorsichtig in jeden Anschluss. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen.
- Das Volumen der in jedem Injektionsanschluss geladenen Verbindung für einen bestimmten Assay finden Sie im Benutzerhandbuch des Geräts. In den in diesem Artikel vorgestellten Experimenten werden 68 μL 50 μM Bam15-Arbeitsmaterial (für mitochondriale Stressassay) oder 68 μL 10 μM Rot / AA-Arbeitsmaterial (für glykolytische Geschwindigkeitsassay) in Port A geladen; 75 μL 10 μM Rot/AA-Arbeitsmaterial (für mitochondriale Spannungstests) oder 75 μL 500 mM 2-DG-Arbeitsmaterial (für glykolytische Geschwindigkeitsanalyse) werden in Port B geladen.
- Laden Sie Injektionsanschlüsse aller Vertiefungen der Platte, einschließlich Hintergrundkorrekturbohrungen und Leerbohrungen, um eine ordnungsgemäße Injektion zu gewährleisten. Laden Sie die jeweilige zusammengesetzte Lösung in jeden Port für die Hintergrundkorrekturbohrungen. Assay-Medium kann anstelle der zusammengesetzten Lösung in jedem der Ports der Bankbohrungen substituiert werden.
- Legen Sie die geladene Sensorkassettenplatte mit abgenommenem Deckel in das Analysegerät ein, um vor dem Assay-Lauf mit der Kalibrierung zu beginnen. Nach Abschluss der Kalibrierung pausiert das Programm automatisch und wartet auf den Austausch der Versorgungsplatte durch die Inselauffangplatte mit Netzhautstempeln.
6. Laden der Inselerfassungsplatte und Starten des Assay-Laufs
- 607 μL des Assay-Mediums zu jeder Vertiefung der Inselauffangplatte geben
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Rand des Netzeinsatzes mit netztinalen Stanzscheiben auf der Oberseite zu greifen und ihn aus der Petrischale zu nehmen. Klopfen Sie leicht auf die Unterseite des Netzeinsatzes auf ein absorbierendes Wischtuch, um zusätzliche Flüssigkeit zu entfernen, und geben Sie sie in den Brunnen der Inselauffangplatte. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Netzeinsätze mit Netzhautstempeln in die Inselauffangplatte gelegt sind. Füllen Sie Hintergrundkorrekturtöpfe und leere Vertiefungen mit leeren Netzeinsätzen.
- Drücken Sie mit zwei Graefe-Pinzetten vorsichtig und vorsichtig auf den Rand jedes Netzeinsatzes und stellen Sie sicher, dass diese sicher an der Unterseite der Inselauffangplatte eingesetzt werden.
- Legen Sie die beladene Inselauffangplatte für 5 minuten in einen 37 °C heißen Inkubator.
- Werfen Sie die Versorgungsplatte nach Abschluss der Kalibrierung aus und ersetzen Sie sie durch eine und ersetzen Sie sie durch die Inselauffangplatte mit abgenommenem Deckel, die Netzhautstempel enthält.
- Setzen Sie den Assay-Lauf fort.
7. Terminierung und Datenspeicherung durchführen
- Werfen Sie nach Abschluss des Laufs die Sensorpatrone und die Inselauffangplatte mit Netzhautstempeln aus. Die Daten werden automatisch als ASYR-Datei gespeichert.
- Verwenden Sie die zugehörige Datenanalyse-Software, um die Daten gemäß dem Benutzerhandbuch des Herstellers anzuzeigen und zu analysieren26.
- Verwenden Sie die Exportfunktion , um die .xslx-Datei der Daten zu exportieren, die mit einer Tabellenkalkulationssoftware angezeigt und analysiert werden kann.
8. Speichern der retinalen Stanzprobe
- Nehmen Sie nach dem Assay die Platte aus der Maschine, entfernen Sie die Sensorkartusche und entfernen Sie das Assay-Medium vorsichtig mit einer Pipette aus jeder Vertiefung.
- Tragen Sie die Abdeckung wieder auf und verschließen Sie die Seiten der Platte mit dem Parafilmstreifen.
- Bei -80 °C lagern.
- Für die Normalisierung quantifizieren Sie den gesamten DNA- oder Proteingehalt des Stempels in jeder Vertiefung.
9. Datenanalyse
- Mitochondrialer Stress-Assay
HINWEIS: Der gemessene OCR-Wert (totalOCR) stellt den gesamten Sauerstoffverbrauch des Gewebes dar. Nach der Injektion mit Bam15 (Uncoupler) steigt die OCR vom Basalspiegel (totalOCRbasal) auf den Höchstspiegel (totalOCRmax) an und sinkt nach der Rot/AA-Injektion. Der Rest-OCR-Wert nach Rot/AA-Injektion (totalOCRRot/AA) stellt den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch dar.- Berechnen Sie den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch wie folgt:
(Gl. 1) Nr. 28
- Berechnen Sie die mitochondriale Reservekapazität (MRC) wie folgt:
(Gl. 2) Nr. 29
HINWEIS: Der letzte Messwert unter den 5 Messungen vor der Bam15-Injektion wird als "basaler" Wert (für totalOCRbasal und mitoOCRbasal) genommen. Der höchste Wert unter den 4 Messungen nach der Bam15-Injektion wird als "max"-Wert (für totalOCRmax und mitoOCRmax) verwendet. Der niedrigste Wert unter den 4 Messungen nach der Rot/AA-Injektion wird als totalOCRRot/AA verwendet.
- Berechnen Sie den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch wie folgt:
- Glykolytische Rate Assay
HINWEIS: Der gemessene ECAR-Wert (totalECAR) stellt die totale Ansäuerung des Mediums durch die Stoffwechselaktivität des Gewebes dar. Im Allgemeinen resultiert die Ansäuerung der extrazellulären Mikroumgebung hauptsächlich aus der Extrusion des glykolytischen Produkts Laktat. Der Katabolismus von Substraten im mitochondrialen TCA-Zyklus führt zur Produktion von CO2, das auch das extrazelluläre Medium durch Hydratation zu Bicarbonat ansäuert.- Subtrahieren Sie mitochondrial beigetragene mittlere Übersäuerung (MitoECAR) von totalECAR, um das GlycoECAR zu erhalten.
(Gl. 3) Nr. 28
HINWEIS: Mitochondriale Atmung und TCA-Zyklus sind stark gekoppelte Prozesse. Die Produktion von CO2 aus Mitochondrien ist eine Funktion der OXPHOS-Rate, die durch mitoOCR messbar ist. - Berechnen Sie das mitoECAR wie folgt:
(Gl. 4) Nr. 28
wobei der CCF (CO2 Contribution Factor) ein empirisch berechneter Verhältniswert ist, der die Höhe des H+-Beitrags aus der CO2-vermittelten Versauerung im Vergleich zu jedem O2-Verbrauch von OXPHOS darstellt. CCF für dieses System ist mit 0,6028 vorbestimmt. Die genaue Messung der Mediumsäuerung wird durch die Pufferkapazität des Mediums, die Empfindlichkeit des pH-Sensors des Instruments und die effektive Messkammerkapazität bestimmt. Hier ist der BF (Buffer Factor) ein Parameter der experimentellen In-situ-Pufferkapazität, der die Menge an H+ oder OH- darstellt, die der effektiven Messkammer hinzugefügt wird, um den pH-Wert um 1 Einheit zu ändern. Wenn ein kundenspezifisches Assay-Medium verwendet wird, kann das BF bestimmt werden, indem bekannte Säuremengen gemäß dem Buffer Factor-Protokoll30 in das Assay-Medium titriert werden. Das in diesem Protokoll verwendete Seahorse DMEM Medium pH 7,4 hat eine vorbestimmte BF von 2,60 mmol H+/L/pH. Die in diesem Protokoll verwendete Inselerfassungsplatte hat eine Volmicrochamber = 16,6 μL31. Der Volumenskalierungsfaktor Kvol ist eine empirisch bestimmte Konstante. Der Kvol-Wert ist für die Inselauffangplatte nicht verfügbar, kann aber aus dem Wert der Mikrotiterplatte28 berechnet werden, der die Volumendifferenz in ihren Mikrokammern berücksichtigt, um 0,41 zu betragen.
HINWEIS: Die Injektion der Rot / AA schaltet die mitochondriale Atmung ab und zwingt das Gewebe, zur ATP-Produktion auf Glykolyse umzuschalten, was zu einer höheren Laktatextrusion und einer Zunahme der ECAR-Messung führt. Die Glykolyse wird mit der 2-DG-Injektion beendet, und die verbleibende ECAR-Messung zeigt eine nicht-glykolytische und nicht-mitochondriale Übersäuerung des Mediums. - Berechnen Sie die glykolytische Reservekapazität (GRC) wie folgt:
(Gl. 5) Nr. 32
wobei der letzte Messwert unter den 5 Messungen vor der Rot/AA-Injektion als "basaler" Wert (glycoECARbasal) genommen wird. Der höchste Wert unter den 4 Messungen nach rot/aA-Injektion wird als "max"-Wert (glycoECARmax) verwendet. Der niedrigste Messwert unter den 4 Messungen nach der 2-DG-Injektion wird als GlycoECAR2-DG verwendet.
- Subtrahieren Sie mitochondrial beigetragene mittlere Übersäuerung (MitoECAR) von totalECAR, um das GlycoECAR zu erhalten.
- Normalisierung
HINWEIS: Die Normalisierung ist unerlässlich, wenn die Messwerte von Netzhautgeweben verschiedener Altersgruppen oder zwischen Wildtyp- und pathologischen/degenerativen Proben verglichen werden, die sich in der Zellzahl unterscheiden können.- Verwenden Sie kommerziell erhältliche Kits, um den DNA-Gehalt in jeder netztinalen Stanzscheibe zu bewerten33,34.
- Alternativ können Sie den Radioimmunrezeptionstestpuffer (RIPA-Puffer) verwenden, um das Gesamtprotein aus dem Netzhautstempel zu extrahieren und den Proteingehalt zur Normalisierung zu verwenden.
HINWEIS: Die Oberfläche einer erwachsenen Mausnetzhaut wurde zuvor auf etwa 20 mm2 bestimmt, und jede Netzhaut enthält ~ 6,5 Millionen Zellen35. Daher ist jeder Netzhautstempel mit einem Durchmesser von 1 mm ~ 1/25 einer einzelnen Netzhaut und enthält ~ 260.000 Zellen. Man kann sich auf diese Zahlen beziehen, wenn man die Daten eines Netzhautstempels mit denen aus anderen Gewebeproben oder kultivierten Zellen vergleicht.
(Gl. 1) Nr. 28
(Gl. 2) Nr. 29
(Gl. 3) Nr. 28
(Gl. 4) Nr. 28
(Gl. 5) Nr. 32Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bei den hier berichteten Daten handelt es sich um repräsentative mitochondriale Stresstests, die OCR-Spuren (Abbildung 1) und Glykolytika-Rate-Assays mit OCR-Spuren und ECAR-Spuren (Abbildung 2) zeigen, die mit frisch separierten 1 mm Netzhautstanzscheiben von 4 Monate alten transgenen Nrl-L-EGFP-Mäusen36 (C57B/L6-Hintergrund) durchgeführt wurden. Diese Mäuse exprimieren GFP spezifisch in Stäbchen-Photorezeptoren, ohne die normale Netzhautentwicklung, Histologie und Physiologie zu verändern, und wurden häufig als Wildtyp-Kontrollen in der Netzhautforschung eingesetzt. Zwei Nrl-L-GFP-Littermat-Mäuse wurden in den hier vorgestellten Assays verwendet. GFP, das in den Nrl-L-GFP-Mäusen exprimiert wird, stört nicht die Messungen von OCR und ECAR in diesem Protokoll. Fünf Netzhautschläge wurden von jeder Netzhaut genommen. Zehn der netztinalen Stempel wurden für den mitochondrialen Stresstest und die anderen 10 für den glykolytischen Geschwindigkeitstest verwendet. Seahorse XF DMEM Medium, pH 7,4 (bestehend aus 6 mM Glucose, 0,12 mM Pyruvat und 0,5 mM Glutamin) und Seahorse XFe24 Islet Capture Platten wurden in den Experimenten verwendet. Die hier dargestellten repräsentativen Daten wurden mit dem gleichen Locher mit einem Durchmesser von 1 mm erhalten, wurden jedoch in Bezug auf den DNA/Proteingehalt nicht normalisiert.
Im mitochondrialen Stresstest wurde der Entkoppler Bam1537 nach Festlegung der OCR-Baseline injiziert, was zu einer erhöhten OCR auf das maximale Niveau führte. Rotenon und Antimycin A wurden injiziert, um die Mitochondrienatmung bei Komplex I bzw. Komplex III zu hemmen, was dazu führte, dass die OCR auf das minimale Niveau sank (Abbildung 1). Die Differenz zwischen dem maximalen OCR-Spiegel und der letzten Messung des basalen OCR-Spiegels spiegelt die mitochondriale Reservekapazität (MRC) wider. Der MRC wird mit Gleichung 2 mit 19,2% ±3,4% berechnet, was mit den zuvor gemessenen MRC-Werten in netzhäuten von ~3 Monate alten Nrl-L-EGFP-Mäusen mit dem Seahorse XF24-Analysator der vorherigen Generation übereinstimmt22,38.
Im Glykolytratentest wurden Rotenon und Antimycin A injiziert, nachdem die Baseline für das Gesamt-ECAR festgelegt worden war. Da die Produktion von ATP aus OXPHOS gestoppt ist, ist das Gewebe gezwungen, sich auf die Glykolyse für Energie zu verlassen, und eine Zunahme der extrazellulären Freisetzung von Laktat treibt ECAR auf das maximale Niveau. Die Glykolyse wird durch Injektion von 2-DG gestoppt, das mit Glucose um die Hexokinase-Bindung konkurriert, wodurch ECAR auf das minimale Niveau sinkt (Abbildung 2). Mitochondrien beigetragenes ECAR (mitoECAR) kann aus dem mitoOCR-Wert (Gl. 4) berechnet werden. Glykolyse-beigetragenes ECAR GlycoECAR wird berechnet und aufgetragen, indem mitoECAR von totalECAR subtrahiert wird. Die Differenz zwischen dem maximalen GlycoECAR-Gehalt und der letzten Messung des GlycoECAR-Basalspiegels spiegelt die Glykolysereservekapazität (GRC) wider. Hier wird der DRK mit 35,7% ± 3,4% unter Verwendung von Gleichung 5 berechnet.
Als hochglykolytisches Gewebe stellt die Laktatproduktion aus der Netzhaut eine Hauptquelle der extrazellulären Übersäuerung dar, wie der geringe Unterschied von GlycoECAR zum TotalECAR zeigt. Interessanterweise stagniert die ECAR-Messung unmittelbar nach der Rot/AA-Injektion nicht, sondern sinkt nach der zweiten Messung. Die retinale Lochscheibe ist ein intaktes Ex-vivo-System , das aus verschiedenen Zelltypen besteht, darunter die Müller-Gliazellen, von denen bekannt ist, dass sie Laktat (Glykolyse-Endprodukt) erhalten, das von den Photorezeptoren freigesetzt wird6. Daher wird ein Rückgang der ECAR-Messung nach der Rot / AA-Injektion wahrscheinlich durch eine erhöhte Entfernung von Laktat aus dem Interzellularraum erklärt, wodurch seine Freisetzung in das Medium verlangsamt / verhindert wird.
Abbildung 1: Mitochondrialer Stresstest. Die geplottete Grafik zeigt ocr-Spuren von 1 mm retinalen Lochscheiben im Seahorse XF DMEM-Puffer, ergänzt mit 6 mM Glucose, 0,12 mM Pyruvat und 0,5 mM Glutamin. Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt der Messungen aus 10 Bohrlöchern dar. Fehlerindikator = Standardfehler. MrC wird mit 19,2% ±3,4% berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Glycolytic Rate Assay. Die geplottete Grafik zeigt die gemessene OCR-Spur, ECAR-Spur (totalECAR) und die berechnete Glykolyse beigesteuerte ECAR (GlycoECAR) aus 1 mm retinalen Lochscheiben in Seahorse XF DMEM-Puffer, ergänzt mit 6 mM Glucose, 0,12 mM Pyruvat und 0,5 mM Glutamin. Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt der Messungen aus 10 Bohrlöchern dar. Fehlerindikator = Standardfehler. GRC wird mit 35,7% ±3,4% berechnet Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Zahl anzuzeigen.
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Discussion
Hier finden Sie detaillierte Anweisungen zur Durchführung von Mikroplatten-basierten Assays der mitochondrialen Atmung und Glykolyseaktivität unter Verwendung von ex vivo, frisch sezierten netztinalen Lochscheiben. Das Protokoll wurde optimiert, um: 1) die Verwendung eines geeigneten Assay-Mediums für ex vivo Netzhautgewebe sicherzustellen; 2) Verwenden Sie die richtige Größe von netztinalen Stanzscheiben, um OCR- und ECAR-Messwerte zu erhalten, die in den optimalen Erfassungsbereich der Maschine fallen; 3) Beschichtung von Netzeinsätzen zur Verbesserung der Haftfähigkeit des Netzhautstempels für eine stabile Ablesung während des Messzyklus; 4) Verwendung der optimalen Konzentration jeder injizierten Arzneimittelverbindung; und 5) eine veränderte Zykluslänge sicherstellen, um bei jedem Schritt ein Plateau der mitochondrialen Zustände zu erreichen. Die Reagenzien und das Protokoll wurden gegenüber einer zuvor veröffentlichten Version23 modifiziert, um sie an die neue Generation der Seahorse XFe24-Maschine anzupassen. Anstelle des im vorherigen Protokoll23 verwendeten Ames-Puffers wird hier ein grundlegendes Seahorse DMEM-Medium verwendet, um die benutzerdefinierte Zusammensetzung der Brennstoffquelle durch separate Zugabe von Glukose, Glutamin und Pyruvat zu ermöglichen. Dies ermöglicht auch die Durchführung verschiedener Assays, bei denen ein bestimmtes Brennstoffsubstrat zugeführt oder dem Medium entzogen wird. In den hier vorgestellten Assays wurde das Medium in der gleichen Konzentration von Glucose (6 mM), Glutamin (0,5 mM) und Pyruvat (0,12 mM) wie im Ames-Puffer konstituiert, die sich als geeignet für Netzhautgewebe erwiesen haben. Ein weiterer Vorteil dieses Mediums (mit 5 mM HEPES) gegenüber dem Ames-Puffer (mit 22,6 mM NaHCO3) ist seine geringe Pufferkapazität, die eine empfindliche und genaue Messung von ECAR28 gewährleistet.
Sowohl mitochondriale Stress- als auch glykolytische Ratenassays können nach dem hier beschriebenen Protokoll mit hoher Präzision durchgeführt werden, wie die engen Standardfehlerwerte zwischen replizierenden Vertiefungen belegen. Es lohnt sich jedoch, die Faktoren zu beachten, die zur Datenvariabilität beitragen können. Vermeiden Sie den Zelltod im Netzhautgewebe. Der gesamte Dissektionsprozess sollte in eiskaltem 1x PBS durchgeführt werden, und der Prozess von der Enukleation der Augen bis zum Einsetzen der Inselauffangplatte mit dem Netzhautstempel in die Maschine sollte 2 Stunden nicht überschreiten. Während der Dissektion der Netzhautschale ist Vorsicht geboten, um eine Schädigung des Netzhautgewebes zu vermeiden, und Stempel sollten nicht aus Bereichen entnommen werden, die durch die Dissektion beschädigt wurden. In jedem Experiment sollte ein neuer, scharfer Biopsiestanzer verwendet werden, und wechseln Sie den Stanzer, wenn die Kante stumpf oder gebogen ist, um Konsistenz und Genauigkeit beim Schneiden von Netzhautstempeln mit einem Durchmesser von 1 mm zu gewährleisten. Versuchen Sie, die Netzhautscheiben in gleicher Entfernung vom Sehnervenkopf zu stanzen, um regionale Variationen (Mitte versus Peripherie) zu vermeiden. Überprüfen Sie nach dem Test jede Vertiefung auf Anzeichen dafür, dass sich der Netzhautstempel vom Netzeinsatz löst. Wenn ein Netzhautstempel eine schlechte Haftung am Netzeinsatz aufweist oder sich während der Messung löst, ändert sich der Abstand von der Sensersonde zum Gewebe, was sich auf die Messwerte auswirkt. Lassen Sie die Daten aus solchen Vertiefungen mit abgetrenntem Netzhautstempel weg.
Die Messung des Echtzeit-mitochondrialen Stoffwechsels in intaktem Netzhautgewebe hat breite Anwendungsmöglichkeiten und kann nützliche Informationen für verschiedene Studien liefern. Diese Assays wurden verwendet, um die mitochondriale Atmung in Netzhautgeweben von Mäusen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund zu messen, um ihren intrinsischen Unterschied in der mitochondrialen Aktivität aufzudecken39,40. Es wurde auch verwendet, um Veränderungen im mitochondrialen Energiestoffwechsel während der Alterung der Netzhaut zu untersuchen38. Durch die Bereitstellung verschiedener Brennstoffsubstrate und die Verwendung verschiedener Inhibitoren, die auf verschiedene Stoffwechselwege abzielen, liefert es Einblicke in die Präferenz der Zelle/des Gewebes bei bestimmten Brennstoffquellen22,38. Darüber hinaus kann der Vergleich zu OCR und MRC zwischen Wildtyp-Maus- und Mausmodellen der vererbten Netzhautdegeneration Hinweise auf mitochondriale Defekte in der degenerierten Netzhaut liefern22.
Es gibt Einschränkungen dieser Technik. Die in diesen Assays verwendete Inselauffangplatte enthält nur 24 Vertiefungen; Daher ist es nur in der Lage, Analysen im mittleren Durchsatz bereitzustellen. Die Datenqualität dieser Methode hängt von der Qualität der retinalen Lochscheiben und der Lebensfähigkeit der Zellen ab. Auch die Retinadissektion und die Herstellung von retinalen Stanzscheiben ist ein zeitaufwendiger Prozess, der eine Hochdurchsatzanalyse an lebenden Ex-vivo-Netzhautgeweben weniger praktikabel macht, selbst wenn 96-Well-Platten verfügbar sind. Im Vergleich zu einer Monoschicht aus kultivierten Zellen beeinflusst das Eindringen der Wirkstoffverbindung in das Netzhautgewebe auch die Datenauslesung. Darüber hinaus stellen die gemessenen OCR- und ECAR-Werte die Gesamtleistung des gesamten Gewebes dar, das sich aus vielen verschiedenen Zelltypen zusammensetzt; Daher muss man bei der Interpretation der Daten die Beziehung und Interaktionen zwischen verschiedenen neuronalen und Gliazellen in der Netzhaut berücksichtigen. Spezifische experimentelle Designs sollten implementiert werden, indem sie auf jedes Projekt zugeschnitten werden. Es wird empfohlen, 3 bis 5 Netzhautstempel (von demselben Auge oder derselben Maus) als technische Replikate einzuschließen und Proben von 3 oder mehr Mäusen als biologische Replikate zu verwenden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Eye Institute (ZIAEY000450 und ZIAEY000546) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
References
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