Dit artikel beschrijft de inkapseling van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) met behulp van een co-axiale stroomfocusapparaat. We tonen aan dat deze microfluïdische inkapselingstechnologie een efficiënte vorming van hPSC-sferoïden mogelijk maakt.
Driedimensionale (3D) of sferoïde culturen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) bieden de voordelen van verbeterde differentiatieresultaten en schaalbaarheid. In dit artikel beschrijven we een strategie voor de robuuste en reproduceerbare vorming van hPSC-sferoïden waarbij een co-axiale stroomfocusapparaat wordt gebruikt om hPSC’s in kern-shell microcapsules te vangen. De kernoplossing bevatte eencellige suspensie van hPSC’s en werd viskeus gemaakt door de integratie van poly(ethyleenglycol) met hoog molecuulgewicht (PEG) en dichtheidsgradiëntmedia. De schelpenstroom bestond uit PEG-4 arm-maleimide of PEG-4-Mal en stroomde langs de kernstroom naar twee opeenvolgende olieknooppunten. Druppelvorming vond plaats bij de eerste olieverbinding met shell-oplossing die zich rond de kern wikkelde. Chemische crosslinking van de schaal vond plaats bij de tweede olieverbinding door een di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol of DTT) in deze druppels te introduceren. De crosslinker reageert met maleimide functionele groepen via klikchemie, wat resulteert in de vorming van een hydrogelschaal rond de microcapsules. Onze inkapselingstechnologie produceerde capsules met een diameter van 400 μm met een snelheid van 10 capsules per seconde. De resulterende capsules hadden een hydrogel-schil en een waterige kern waarmee afzonderlijke cellen zich snel konden samenvoegen tot aggregaten en sferoïden konden vormen. Het proces van inkapseling had geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van hPSC’s, met >95% levensvatbaarheid waargenomen 3 dagen na inkapseling. Ter vergelijking: hPSC’s ingekapseld in vaste gelmicrodeeltjes (zonder een waterige kern) vormden geen sferoïden en hadden 3 dagen na inkapseling <50% levensvatbaarheid. Sferoïde vorming van hPSC's in kern-shell microcapsules vond plaats binnen 48 uur na inkapseling, waarbij de sferoïde diameter een functie was van de celinentingsdichtheid. Over het algemeen was de microfluïdische inkapselingstechnologie die in dit protocol wordt beschreven zeer geschikt voor hPSCs-inkapseling en sferoïdevorming.
Er is veel belangstelling voor 3D-culturen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) vanwege de verbeterde pluripotentie en differentiatiemogelijkheden die dit kweekformaatbiedt 1,2,3. hPSC’s worden meestal gevormd tot sferoïden of andere 3D-cultuurformaten door middel van bioreactoren, microwells, hydrogels en polymere steigers 4,5,6. Inkapseling biedt een ander middel om enkele hPSC’s in sferoïden te organiseren. Eenmaal ingekapseld kunnen hPSC-sferoïden gemakkelijk worden behandeld en overgebracht naar microtiterplaten voor differentiatie, ziektemodellering of experimenten met het testen van geneesmiddelen. Het inkapselen van hPSC’s in een hydrogellaag beschermt cellen ook tegen afschuifschade en maakt het mogelijk om sferoïden in een bioreactor te kweken met hoge roersnelheden7.
Onze methodologie voor stamcelinkapseling evolueerde in de loop van de tijd. Ten eerste hebben we ons gericht op vaste hydrogel-microdeeltjes en succesvolle inkapseling en kweek van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) aangetoond)8. Er werd echter opgemerkt dat menselijke embryonale stamcellen (hESCs) een lage levensvatbaarheid hadden wanneer ze werden ingekapseld in dergelijke hydrogel-microdeeltjes, vermoedelijk vanwege de grotere behoefte van deze cellen om cel-celcontacten na de inkapseling te herstellen. We redeneerden dat heterogene microcapsule, die een waterige kern bezit, beter geschikt kan zijn voor inkapseling van cellen die afhankelijk zijn van een snel herstel van cel-celcontacten. Het concept van co-axiale flowfocus microfluïdische apparaat voor het maken van waterige kern / hydrogel shell microcapsules werd aangepast van He et al.9, maar in plaats van alginaat dat in de oorspronkelijke benadering werd gebruikt, werd een peg-gebaseerde hydrogel in de schaal opgenomen. We toonden voor het eerst succesvolle inkapseling en sferoïde vorming van primaire hepatocyten in core-shell microcapsules10 en meest recent beschreven inkapseling van hES- en iPS-cellen7. Zoals beschreven in figuur 1A, worden capsules vervaardigd in een stroomfocusapparaat waarbij de shell- en kernstroomstromen overgaan van zijwaartse naar co-axiale stroom voordat ze in de oliefase worden uitgeworpen. De kernstroom bevat cellen en additieven die de viscositeit van de oplossing verhogen (niet-reactieve PEG MW 35kD en iodixanol – handelsnaam OptiPrep), terwijl de shell-stroom reactieve moleculen (PEG-4-Mal) bevat. Continue co-axiale stroomstroom wordt gediscretiseerd in druppels die de core-shell-architectuur behouden. De kern-schilstructuur wordt permanent gemaakt door blootstelling aan di-thiol crosslinker (DTT), die reageert met PEG-4-Mal via klikchemie en resulteert in de vorming van een dunne (~ 10 μm) hydrogelhuid of -schaal. Nadat de emulsie is gebroken en capsules in een waterige fase zijn overgebracht, diffunderen moleculen van PEG uit de kern en worden vervangen door watermoleculen. Dit resulteert in waterige kern en hydrogel shell microcapsules.
Hieronder vindt u stapsgewijze instructies voor het maken van microfluïdische apparaten, het voorbereiden van cellen en het inkapselen van hPSC’s.
Het hier beschreven inkapselingsproces resulteert in reproduceerbare vorming van hPSC-sferoïden. Het microcapsule-formaat maakt het gemakkelijk om sferoïden in putten van een microtiterplaat te doseren voor experimenten gericht op het verbeteren / optimaliseren van differentiatieprotocollen of het testen van therapieën. Ingekapselde stamcelsferoïden kunnen ook worden gebruikt in suspensieculturen waar hydrogelschaal cellen beschermt tegen door afschuiving veroorzaakte schade7.
<p class="jo…The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de subsidies van het Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) en NIH (DK107255).
0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
1x DPBS | Corning | 23220003 | |
4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
Digital hot plate | Dataplate | ||
Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
Magic tape | Staples | 483535 | |
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |