Обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в афферентных нейронах вагусного нерва мыши с использованием мультиплексной гибридизации In Situ
Summary
Мультиплексная гибридизация in situ (ISH) использовалась для одновременной визуализации транскриптов для двух рецепторов, связанных с G-белком, и одного фактора транскрипции во всем вагусном ганглионном комплексе взрослой мыши. Этот протокол может быть использован для создания точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.
Abstract
В этом исследовании описывается протокол мультиплексной гибридизации in situ (ISH) яремно-узловатых ганглиев мышей с особым акцентом на обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Формалин-фиксированные яремно-узловатые ганглии обрабатывали с помощью технологии RNAscope для одновременного обнаружения экспрессии двух репрезентативных GPCR (холецистокининовых и грелиновых рецепторов) в сочетании с одним маркерным геном либо узелка (парно-подобный гомеобокс 2b, Phox2b), либо яремных афферентных нейронов (PR-домен цинкового белка пальца 12, Prdm12). Меченые ганглии были изображены с использованием конфокальной микроскопии для определения распределения и паттернов экспрессии вышеупомянутых транскриптов. Вкратце, было обнаружено, что афферентные нейроны Phox2b обильно экспрессируют рецептор холецистокинина (Cck1r), но не рецептор грелина (Ghsr). Было также обнаружено, что небольшое подмножество афферентных нейронов Prdm12 экспрессирует Ghsr и / или Cck1r. Обсуждаются потенциальные технические предостережения при проектировании, обработке и интерпретации мультиплексного ISH. Подход, описанный в этой статье, может помочь ученым в создании точных карт транскрипционных профилей вагусных афферентных нейронов.
Introduction
Клеточные тела вагусных афферентов содержатся в яремных, петрозальных и узловыхганглиях 1,2,3. Их аксоны путешествуют вместе через несколько ветвей блуждающего нерва в краниоцервикальную, грудную и брюшную зоны4,5,6,7. Из своих висцеральных окончаний вагусные афференты могут реагировать на широкий спектр физиологических и вредных раздражителей8,9,10. Однако распределение сигнальных молекул и рецепторов, участвующих в вагусном зондировании, остается плохо охарактеризованным. Отчасти это связано с тем, что вагусные ганглии, несмотря на свои небольшие размеры, экспрессируют широкий спектр рецепторов, включая большое количество GPCR8,11,12,13. Кроме того, вагусные афферентные нейроны по своей природе неоднородны и имеют различные молекулярные профили14. Чтобы усложнить дело, яремные, петрозальные и узловые ганглии прикрепляются к мыши, образуя тем самым единую ганглионную массу. Наконец, у подмножества животных узелковый ганглий прикреплен к симпатическому верхнему шейному ганглию15.
В прошлом исследователи обращались к иммуногистохимии для изучения нейрохимического состава вагусных афферентных нейронов16,17,18. Хотя иммуногистохимия с использованием валидированных антител полезна, результаты иммуногистохимических исследований следует интерпретировать с осторожностью. Например, многочисленные усилия по выявлению специфических антител против GPCR потерпели неудачу19,20,21,22,23,24,25,что привело исследователей к выводу, что большинство антител против GPCR ненадежны. Чтобы обойти эти проблемы, количественная ПЦР (qPCR) широко используется для оценки экспрессии генов у ганглионной массы блуждающего блуждающего нерва26,27,28,29. Однако изучение экспрессии генов с помощью qPCR происходит за счет потери пространственной информации. В частности, невозможно предсказать, сколько клеток или какой тип (типы) клеток экспрессируют конкретный ген, представляющий интерес (например, узелковые или яремные клетки). Повторяющиеся проблемы также включают загрязнение соседними тканями и включение переменной длины блуждающего нерва, верхнего шейного отдела и яремных ганглиев во время рассечения15. В результате вышеуказанных трудностей споры окружают экспрессию и распределение нескольких GPCR в вагусных афферентных нейронах. Один особенно загадочный пример относится к рецептору грелина (Ghsr). В то время как некоторые исследования обнаружили широкую экспрессию этого рецептора в вагусных афферентных нейронах30,31,32,другие обнаружили, что мРНК Ghsr почти не обнаруживается в узловом ганглиях11,14. Поэтому детальное картирование мРНК Ghsr в ганглионной массе блуждающего нерва оправдано.
Гибридизация in situ (ISH) также использовалась для оценки паттернов экспрессии генов в вагусной ганглионной массе7,11,12,33,34,35. Поскольку методы на основе РНК остаются более надежными и специфичными, чем методы на основе антител в большинстве случаев36,37,исследования ISH оказались ценными для лучшего понимания нейрохимического кодирования вагусных афферентных нейронов. Тем не менее, традиционные техники ISH сами по себе не лишены предостережений. Радиоактивный ISH чувствителен, но генерирует фон и остается громоздким38. Нерадиоактивный ISH менее сложен, но именее чувствителен 38. Напротив, недавно разработанный метод RNAscope ISH является высокочувствительным и генерирует минимальный фон39. В текущем исследовании применялся мультиплексный флуоресцентный РНКАскоп для обнаружения GPCR в вагусных афферентных нейронах мыши. Мы сосредоточились на картировании распределения Ghsr и сравнили его распределение с распределением рецептора холецистокинина (Cck1r), другого GPCR, который, как известно, экспрессируется в узловом ганглии34. Наконец, два фактора транскрипции, пароподобный гомеобокс 2b (Phox2b) и PR-домен цинкового белка пальца 12 (Prdm12), были использованы в качестве селективных маркеров для узловых и яремных афферентных нейронов, соответственно14. Без визуализации Phox2b или Prdm12 было бы сложно с уверенностью идентифицировать яремные и узловатые афференты. Потенциальные технические подводные камни также обсуждаются на протяжении всей статьи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Техника ISH была изобретена в конце 1960-х годов42года. Однако только в середине 1980-х годов он был применен для обнаружения мРНК в центральной и периферической нервной системах43,44. Учитывая неоднородность нервной системы и повторяющиеся проблем?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core, финансируемой грантом NIH #5P01DK119130-02. Авторы хотели бы отметить помощь Юго-западного центра визуализации живых клеток UT (возглавляемого доктором Фелпсом) и его сотрудников (Абхиджит Бугде и Марсель Меттлен), частично поддерживаемых грантом NIH Grant #1S10OD021684-01, общим ресурсом Онкологического центра Гарольда С. Симмонса, частично поддерживаемым грантом поддержки онкологического центра NCI, P30 CA142543.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O’Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. 신경과학. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D’Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
