Summary
本議定書は、農薬に汚染された規定を孤独なミツバチの幼虫、 オスミア・ショベルタに供給する方法を説明している。この手順は、孤独なミツバチの幼虫に対する農薬の生態毒性を調べる。
Abstract
花粉媒介者の農薬の現在の生態学的リスク評価は、主に実験室の状態のみを考慮してきた。孤独なミツバチの幼虫にとって、農薬で汚染された食物の摂取は、人口統計学的観点から、幼虫の死亡率を増加させ、来年の成虫の孤独なミツバチの収集率および個体数を減少させる可能性がある。しかし、孤独なミツバチの幼虫に対する農薬の影響に関する研究は限られています。したがって、農薬が孤独なミツバチの幼虫にどのように影響するかを理解することは、農薬の生態学的リスク評価の不可欠な部分と考えるべきである。本研究は、孤独なミツバチの幼虫である オスミア・ショベルタ を致死的または致死以下の量の農薬に曝露し、幼虫の体重増加、発生期間、収穫能力、および摂取した食物の食物消費効率の変換を追跡する方法を提示する。この方法の有効性を実証するために、 O. excavata の幼虫に、急性致死量および亜致死量のクロルピリホスを含む規定を与えた。次に、処理した幼虫の上記の指標を調査した。この技術は、花粉媒介者に対する農薬のリスクを予測し、軽減するのに役立ちます。
Introduction
花粉媒介者は、現代のグローバル農業の生態系サービスにおいて重要な役割を果たしています。ミツバチ(アピスメリフェラ;膜翅目:Apidae)は伝統的に作物の不可欠な経済的花粉媒介者と考えられてきましたが、最近の研究は、オスミア(膜翅目:Megachilidae)が特定の作物の受粉を改善し、果実のサイズと種子の数を増やし、世界のさまざまな地域の商業果樹園における非対称果実の割合を減らす上でも非常に重要であることを示唆しています1。Osmia excavataは、中国北部と北西部、日本2,3,4のように、主にアジアでリンゴの受粉に理想的な種と考えられてきました。それは、類似または時にはより高い効率で特定の作物に受粉サービスを提供することができます。この点で、それらはミツバチ4、5、6と相乗効果で置き換えられるか、または働くことが示されている。
O. excavataの生物学的特徴は、社会的なミツバチと比較してユニークです。その一兆性、孤独な、そして営巣活動は主に春と初夏に起こります。O. excavataの巣は、通常、既存の穴、典型的には枯れ木、中空の植物、わらの管、および自然条件の竹の茎に見られる3。大人のO.ショベルは、その繭から現れて交尾し、花粉を集め、卵を産むための巣を作り、1週間後に孵化し始めます。受精卵は雌に発達し、未受精卵は雄に発達する3。雌は蜂管の底に分布しており、対応する規定はより重要です。対照的に、男性はマイナー規定7でチューブ出口の近くにいたので、男性が最初に出て、女性が後で出てきます。雌は花粉と少量の蜜を、細胞8内の各幼虫の唯一の食物源である湿った塊に混ぜる。
いくつかの研究では、受粉昆虫の個体数が9,10個減少したことが報告されています。農薬の広範な使用は、花粉媒介者の豊富さと多様性を低下させる主な要因の1つとして特定されており、受粉サービスを危険にさらす可能性もあります11,12。農薬の副作用を軽減・軽減するためには、花粉媒介者に対して農薬リスク評価を実施する必要があります。一部の国では、使用される農薬からミツバチへの安全性を確保するために規制の枠組みが確立されています13,14。最近の研究では、オスミアはミツバチよりも農薬の影響を受けやすいことが示されています1,15。
興味深いことに、ほとんどのリスク評価は成体のミツバチに焦点を当てていた11,12。O.ショベル、特に幼虫に関する研究はほとんど行われていない。さらに、農薬によって直接引き起こされるオスミアの死亡率は、最も一般的には16と考えられている。それでもなお、幼虫の体重増加、発生期間、摂食パターン、排卵能力、その後の成虫行動、および繁殖力などの慢性毒性は、急性致死毒性と同じ害を有する可能性があり、孤独なミツバチ17に対する有効な実験方法の欠如のためにしばしば無視される。
これまで、孤独なミツバチの幼虫に対する農薬の効果を評価するために2つの方法が使用されてきた:(1)適量の農薬が、孤独なミツバチの卵を除去することなく、規定の局所的な場所に施用された1,18,19,20;(2)規定を特定量の農薬21を含む人工花粉・蜜混合物で置き換える。ただし、上記の 2 つの方法にはいくつかの制限があります。前者は急性毒性しか測定できませんが、幼虫が短期間に全用量を摂取したため、慢性毒性は測定できません。後者は、人間の操作のために高い死亡率につながるでしょう1。ここでは、実環境における規定において残留農薬を摂食する幼虫の挙動をシミュレーションすることにより、高度に制御された研究条件下でのO.ショベルバに対する農薬の生態毒性を研究する浸漬法について説明した。本研究の方法は、上記2つの方法の欠点を解決し、有害物質が急性および慢性毒性に及ぼす影響を測定するのに適している。
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Protocol
1. 供給チューブの準備
- 電気巻鉄を使用して、2 mL 遠沈管の蓋に穴 (直径約 0.3 mm) を打ち抜きます ( 材料表を参照)。このような遠心管を使用して、 O. excavata 幼虫およびその供給塊を維持する。
2. 農薬の調製
- 技術グレードの農薬( 材料表を参照)をアセトンに溶解し、1 x 104 μg a.i. mL-1のストック溶液を取得します。次いで、溶液の5つ以上の濃度への勾配希釈を行う。
注:この研究では、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μgのa.i. mL-1 のクロルピリホスが使用されました。
3. 規定の作成
- O.ショベルの規定( 材料表を参照)と新しく孵化したO .ショベル の幼虫を含むプラスチック製のミツバチ管を大量飼育プログラムから入手する。
注:開花の20日前から開花期全体まで農薬は使用しませんでした。化学分析の結果、無作為に選択された50の規定で一般的に使用される農薬含有量は、両方とも最小試験レベルを下回っていたことが示された。 - 柔らかいブラシを使用して静かに規定と幼虫を分離します。巣9内の規定サイズと細胞位置に基づいて雌幼虫を選択する。次に、均一なサイズの規定と選択された雌の幼虫をペトリ皿(直径60mm)に置き、使用のためにそれらを脇に置いておく。
注:一般的に使用される農薬の内容を分析するために、クロルピリホス、イミダクロプリド、フェンジフェヌロン、フォキシム、アベルメクチンの50の規定がランダムに選択されました。ソフトブラシのパラメータは、(a)ブラシの直径:0.3 mm、(b)ブラシの長さ:2 cm、(c)ペンの長さ:18 cmです。
4. 農薬による処理の提供
- ケージを使用して、選択した均等なサイズの規定(ステップ3.2から;クロルピリホス0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μgのa.i. mL-1)に希釈農薬(ステップ3.2から)を10秒間浸します。対照チェック(CK)を0.2%溶媒(本試験ではアセトン)に浸す。
注:濃度処理ごとに3回の反復があり、各反復は60個の規定で構成されていました。各規定の投与量の差は、均等なサイズの規定を選択することによって減少させることができる。 - 農薬で規定を処理する前後の農薬溶液の量を測定します。次いで、60質量規定を含む各処理における殺虫剤の浸漬体積を計算する(補足表1)。滅菌作業台上の風乾後、穴の開いた別々の遠心管(ステップ1.1から)に規定を置きます。
注:実験の前に、規定を入れたケージを農薬溶液に入れ、浸漬前後の農薬溶液の体積を測定して誤差をなくしてください。 - 柔らかいブラシを使用して、雌の幼虫を自然に乾燥した規定の表面に個々に移す。
注:1つのチューブに1匹の幼虫。
5. 成長条件
- O. ショベル の幼虫を暗所の生育室内に戻し、相対湿度65%~75%、2°C16で25±した。
6. 結果の検討
- 急性致死毒性試験
- 幼虫を処理済みおよび対照(CK)規定に48時間置いた後、幼虫の死亡率を測定する。
注:死亡基準:幼虫が軽度の接触に反応しなかった場合、ブラックライトランプ22の下で柔らかいブラシを使用した。ブラックライトランプは、幼虫の暗い成長条件をシミュレートし、成長指標をチェックする際に幼虫への光の影響を避けるために使用された。人為的ミスを排除するために、対照群における48時間後の規定からの幼虫の除去の有無にかかわらず死亡率も測定された。 - 昆虫飼育試験の48時間前後に60個の規定を計量し、各幼虫が消費する供給量を決定する。
- 各幼虫が消費する各濃度での農薬の用量を、食べられた供給物の割合および各供給物の農薬含有量に従って計算する。
注:線量計算の式は23です。
ここで、Dは各幼虫による農薬の消費用量である。W1は農薬の注入前の60規定の重量である。W2 は、48 時間後の 60 規定の残りの重量です。V1は、60規定の浸漬前の農薬の量です。V2は、60規定の浸漬後の農薬の量である。Cは農薬の濃度である。
- 幼虫を処理済みおよび対照(CK)規定に48時間置いた後、幼虫の死亡率を測定する。
- 致死性以下の毒性試験
- 飼育試験前および14日間の治療後に幼虫を計量し、幼虫の体重増加を決定する。
- ブラックライトランプの下で繭を繭付けしている間、 O.ショベル を毎日観察して、幼虫の発育期間を測定します。
- 処理済みおよびCK規定の摂食の14日後に規定の残りの部分を計量し、摂取された食物の消費および変換効率(ECI)24を計算する。
- 対照ミツバチが成虫に出現したときに小さなはさみを使って繭を狙撃して、侵入の数を調べます。
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Representative Results
規定における一般的に使用される農薬、クロルピリホス、イミダクロプリド、フェンジフェヌロン、フォキシム、アベルメクチンの含有量は、対照群における定量限界(0.01〜0.02mg kg-1)未満であった。これらの結果は、各治療に対する残留農薬の影響を除外した。対照群における48時間後の幼虫を規定から除去した有無にかかわらず死亡率を評価した。結果は有意差を示さず(表1)、軽微な人為的ミスを示した。
急性致死毒性試験(表2)では、規定を7つの希釈農薬溶液(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、および6.4μgのa.i. mL-1クロルピリホス)および0.2%アセトン(対照群として)に浸した。対数プロビット回帰分析では、農薬の摂取量(0.0001〜0.005μgのa.i. mL-1の範囲)および48時間の治療後の幼虫の対応する死亡率に従って、O. excavataに対する農薬の致死量の中央値(LD 50値)を評価した。結果は、O. excavataの幼虫に対するクロルピリホスのLD50値が0.001(0.001〜0.002)μgであるa.i. Bee−1であることを示した。
致死的毒性試験では、 O. excavata の幼虫の体重増加、発生期間、閉鎖速度、消費、およびECIを、クロルピリホスの0.1、0.2、0.4、および0.8μgのa.i. mL-1 の浸漬濃度下で評価した。共分散分析(ANCOVA)を用いて、 O.ショベルの発達(排泄速度を除く)および食物利用における治療関連の変化を決定した。対照的に、初期供給質量は共変量として使用された。用量が増加するにつれて、幼虫の体重増加、消費、およびECIの指標値は治療のために減少し、0.013μgのa.i. bee-1 クロルピリホスで観察された対照と比較して最も低い値であった。逆に、最も延長された幼虫の発生持続時間は、対照処置と比較して0.016μgのa.i. bee-1クロ ルピリホスで観察された(図1)。
クロルピリホスのエクロジオン速度への影響は、一元配置分散分析(ANOVA)とテューキーの最小有意差(LSD)検定を用いて評価されました。ピアソンの相関関係は、クロルピリホスの摂取量と O.ショベル の浸食率との関係を分析するためにも行われた。ここで、この分析の結果は、処理に対して有意な負の線形関係が存在することを示した(R2 = 0.82、 P = 0.03)。摂取された用量が0.002μgのa.i. bee-1 を超えた場合、エクロジオン率は対照治療の用量よりもかなり低かった(図2)。
図1:O.掘削物の成長、発達、および摂食に対するクロルピリホスの影響(A)、(C)、(D):治療の14日後;(B):O.の繭打ち前に発掘する。異なる小文字は、P<0.05での治療間の有意差を示す。SD を使用した各データ ポイントの平均の数値。この数値の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:クロルピリホスの摂取量とO.ショベルの浸出率との関係。異なる小文字は、P<0.05における治療間の有意差を示す。SDを使用した各データ ポイントの平均の数値。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 治療 | 死亡率 | |
| 繰り返し | 意味する | |
| 幼虫の除去 | 11.91% | 9.67% a |
| 7.63% | ||
| 9.46% | ||
| 幼虫の除去なし | 6.88% | 8.28% a |
| 7.37% | ||
| 10.59% | ||
表1:対照群における48時間後の規定から幼虫を除去した有無にかかわらず死亡率。 同じ小文字は 、P < 0.05での治療間で有意差がないことを示します。
| 殺虫剤 | SE±スロープ | ティッカー | χ2 (P) | LD50 (95% 信頼区間) (μg a.i. bee−1) |
LD90 (95 % CI) (μg a.i. bee−1) |
| クロルピリホス | y=3.23+0.30x | 5 | 5.38 (0.37) | 0.001 (0.001-0.002) | 0.02 (0.012-0.038) |
表2:48時間の治療後のオスミア掘削機に対するクロルピリホスの毒性。SE - 標準誤差。Df - 自由度;χ2-カイ二乗の値;CI - 機密間隔。
補足表1:各処置における殺虫剤の浸漬容積を、60の大量規定を含む。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
成虫の花粉媒介者の場合、農薬の生態毒性を測定するための2つの主要な方法があります。1つは、殺虫昆虫の胸郭に農薬を施用する接触方法である。もう1つは胃毒性法で、成虫の花粉媒介者に農薬25,26を含む蜂蜜水が供給されます。近年、O.ショベルの受粉効果や開花率が比較的低いことが分かっている27。幼虫の成長および発達に対する農薬施用の影響が主な理由の1つであると推測される。しかしながら、O. excavataの幼虫に対する農薬の毒性評価方法に関する報告はほとんどない。本研究では、供給塊を農薬で汚染することにより、O. excavataの幼虫の死亡率、成長、発達、摂食に対する農薬の影響を評価するための効果的な方法が提案されている。
多くの研究は、ミツバチに対する農薬の毒性を評価するために致死的な中濃度を含むスクロース溶液を使用した28、29、30。孤独なミツバチへの農薬曝露の主な経路は、幼虫または成虫の摂取、接触、および経卵巣感染であった31。この研究の方法は、野外で農薬を含む食物に直接接触して摂食することに対する孤独な成虫ミツバチの反応をシミュレートした。孤独なミツバチの幼虫の場合、その応答は、生物学的特性に従って供給塊中の残留農薬を食べていた。さらに、畑の規定にさらされた農薬は、O. excavataの幼虫によって食べられる前に、分解、揮散、他の組織への伝導を被るであろう。したがって、浸漬に農薬濃度を使用するよりも、幼虫が摂取する農薬用量を分析することによって、O.ショベルバに対する農薬の生態毒性を評価する方がよい。
規定はサイズが大きく異なり、幼虫および成虫の質量に実質的に影響を及ぼす可能性がある。規定および雌幼虫は、錬量および巣内の細胞位置に基づいて誤差を最小限に抑えるために選択された。さらに、上記の方法によるスクリーニングの後、同様のサイズの規定がさらに選択された。作業負荷のこの部分は比較的大きいが、本研究における幼虫当たりの食物消費量および各濃度における農薬の量に関する統計には不可欠である。これにより、農薬の摂取量を正確に算出することができた。野外適用後の異なる時間に規定内の残留農薬を決定するフォローアップ作業は、成虫のO.ショベルの放出時間を導き、O.ショベルタの幼虫に対する農薬の悪影響を軽減するのに役立つ。
クロルピリホスはO. excavataの幼虫に対する致死率が高く、成体の花粉媒介者(Apis melliferaおよびApis cerana)で報告された結果と類似していた32,33。この研究の方法は、O. excavataの幼虫に対する農薬の毒性を予測できることがわかる。しかし、以前の研究では、死亡率が低いことは均一なストレス反応ではなく、花粉媒介者への悪影響を示すものではないことが分かっています。例えば、ネオニコチノイドは、ミツバチ34の急性死を引き起こすには不十分であるが、嗅覚学習および記憶ならびに営巣および収集活動の能力を損なう可能性がある35、36、37、38、39、40。したがって、人口統計学的観点から花粉媒介者に対する農薬の生態毒性を包括的に理解するためには、O. excavataの幼虫に対する農薬の慢性毒性を評価することが不可欠である。しかし、この方法は、O. excavataの幼虫の幼虫の体重増加、発育期間、摂食パターン、および侵入能力を評価した。成虫に出現した後の飛行能力および繁殖力は評価されなかった。
本研究にはまだいくつかの限界がある。規定は浸漬溶液の100%を吸収すると仮定した。それでも、各規定の量と湿度は異なる濃度をもたらす可能性があり、摂取された食品と食品で使用される名目試験濃度の検証の両方が用量ベースで毒性エンドポイントを報告する際に必要であることを示しているため、この仮定は分析的に検証されるべきである。従って、今後も分析法を用いて規定中の農薬濃度を検証することが依然として必要である。
要約すると、提示された方法は、死亡率、幼虫の体重増加、発生期間、侵入能力、および摂食パターンに関連するエンドポイントを評価することによって、研究者が孤独なミツバチの幼虫に対する農薬の生態学的リスクを改善するのに役立つ。この技術は、半野外実験や野外実験では入手が困難な孤独なミツバチの幼虫に関する定量データを生成することで、農薬使用の安全性を高める可能性があります。孤独なミツバチに対する農薬の悪影響は、この技術を利用してよりよく予測され、軽減することができます。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、中国の国家主要研究開発プログラム(2017YFD0200400)、主要科学技術イノベーションプロジェクト(2017CXGC0214)、山東省ミツバチ産業イノベーションチーム、山東省農業科学アカデミー農業科学技術イノベーションプロジェクト(CXGC2019G01)、山東省農業科学アカデミー農業科学技術イノベーションプロジェクト(CXGC2021B13)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abamectin | Jinan Lvba Pesticide Co. Ltd | ||
| Black-light lamps | Kanghua Medical Device Co., Ltd | ||
| Centrifugal tube box with 100 Wells | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | ||
| Centrifuge tube | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | 2 mL; Serve as bee tube | |
| Electric soldering iron | Kunshan Kaipai Hardware Electromechanical Co., Ltd | ||
| Electronic scale | Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd | 3137510295 | |
| Graduated cylinder | Anhui Weiss Experimental Equipment Co. Ltd | ||
| Petri dishes (60 mm diameter) | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | ||
| Pollen provision | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd | ||
| Soft brush | Wengang Wenhai painting material factory | ||
| Solitary bees | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd |
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