Summary
本议定书解释了一种将受农药污染的食品喂给孤独蜜蜂 Osmia excavata的方法。该程序检查杀虫剂对孤独蜜蜂幼虫的生态毒性。
Abstract
目前对授粉媒介杀虫剂的生态风险评估主要只考虑了实验室条件。对于独居蜜蜂的幼虫，从人口学角度来看，摄入受杀虫剂污染的幼虫可能会增加幼虫的死亡率，降低收集率和下一年成年独居蜜蜂的数量。但是关于杀虫剂对孤独蜜蜂幼虫的影响的研究有限。因此，了解农药如何影响独居蜂的幼虫应被视为农药生态风险评估的一个组成部分。本研究提出了一种将独生蜜蜂 Osmia excavata 的幼虫暴露于致死或亚致死剂量的杀虫剂的方法，跟踪幼虫体重增加，发育持续时间，闭合能力和摄入食物的食物消耗效率转换。为了证明该方法的有效性，向 挖掘螈虫 幼虫喂食含有急性致死性和亚致死剂量的毒死蜱。然后，研究了处理过的幼虫的上述指标。该技术有助于预测和减轻杀虫剂对授粉媒介的风险。
Introduction
传粉媒介在现代全球农业的生态系统服务中发挥着关键作用。而蜜蜂（Apis mellifera;膜翅目：Apidae）传统上被认为是作物的基本经济授粉媒介，最近的研究表明， Osmia （膜翅目：Megachilidae）在改善某些作物的授粉，增加果实大小和种子数量以及减少世界不同地区商业果园中不对称果实的比例方面也非常重要1。 Osmia excavata 被认为是苹果授粉的理想物种，主要在亚洲，如中国北部和西北部以及日本2，3，4。它可以为某些具有相似或有时效率更高的作物提供授粉服务。在这方面，它们已被证明可以取代蜜蜂或与蜜蜂4，5，6协同作用。
与群居蜜蜂相比， 挖掘狸藻 的生物学特征是独一无二的。其单伏，孤独和筑巢活动主要发生在春季和初夏。 挖掘 草的巢通常存在于预先存在的孔中，通常在自然条件下的枯木，空心植物，稻草管和竹茎中3。成年 的挖掘鸟 从茧中出来交配，收集花粉，并筑巢产卵，一周后开始孵化。受精卵发育成雌性，而未受精卵发育成雄性3。雌性分布在蜂管的底部，相应的规定更为显著。相比之下，雄性在管出口附近，次要规定7，所以雄性先出来，雌性出来后。雌性将花粉与少量花蜜混合成一个湿润的斑点，这是细胞8中每个幼虫的唯一食物来源。
几项研究报告说，授粉昆虫的数量减少了9，10。农药的广泛使用已被确定为减少授粉媒介丰度和多样性的主要因素之一，也可能危及授粉服务11，12。为了减少和减轻农药的不利影响，有必要对授粉媒介进行农药风险评估。一些国家已经建立了监管框架，以确保蜜蜂安全免受农药使用的13，14。最近的研究表明， Osmia 比蜜蜂更容易受到杀虫剂的影响1，15。
有趣的是，大多数风险评估都集中在成年蜜蜂11，12;对 挖掘狸藻，特别是幼虫的研究很少。此外，由杀虫剂直接引起的 Osmia 的死亡率最常被认为是16。尽管如此，诸如幼虫体重增加，发育持续时间，进食模式，诱发能力，随后的成年行为和繁殖力等慢性毒性可能与急性致死毒性具有相同的危害，并且由于缺乏针对孤独蜜蜂的有效实验方法而经常被忽视17。
到目前为止，采用两种方法评估农药对独居蜂幼虫的影响：（1）在规定的局部部位施用适量农药而不去除独居蜂卵1，18，19，20;（2）用含有特定量农药的人工花粉-花蜜混合物代替规定21。但是，上述两种方法存在一些限制。前者只能测量急性毒性，但不能测量慢性毒性，因为幼虫在短时间内摄入了整个剂量;后者将导致高死亡率，因为人为操作1。本文通过模拟真实环境中以残留农药为食的幼虫行为，描述了浸泡法，研究了在高度受控的研究条件下农药对漏斗草的生态毒性。本研究的方法解决了上述两种方法的缺点，适用于测量有害物质对急性和慢性毒性的影响。
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Protocol
1. 喂料管的准备
- 使用电绕组铁在 2 mL 离心管的盖子上打孔（直径约 0.3 mm）（参见 材料表）。使用这种离心管来维持 挖掘芽孢 杆菌幼虫及其供应质量。
2. 农药的制备
- 将工业级农药（见 材料表）溶解在丙酮中，以获得1 x 104μg 的储备溶液。然后，对溶液进行梯度稀释至五种以上的浓度。
注：本研究使用0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4微克的毒死蜱。
3. 条款的准备
- 从大规模养殖计划中获取含有供应品的塑料蜂管（见 材料表）和新孵化的 挖掘猪笼 草幼虫。
注意：从开花前20天到整个开花期不使用杀虫剂;化学分析结果表明，随机选择的50种制剂中常用农药含量均低于最低检测水平。 - 分开食物，用软刷轻轻地幼虫。根据巢穴9内的供应大小和细胞位置选择雌性幼虫。然后，将大小均匀的幼虫和选定的雌性幼虫放在培养皿（直径60毫米）中，并将它们放在一边使用。
注：随机抽取50种农药分析常用农药含量：毒死蜱、吡虫啉、芬地非脲、磷、阿维菌素。软刷参数为（a）画笔直径：0.3毫米，（b）画笔长度：2厘米，（c）笔长：18厘米。
4. 提供农药处理
- 将所选均匀大小的配料（来自步骤3.2）浸泡在稀释的农药（来自步骤2.1;毒死蜱在0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4μg a.i.mL-1）中使用笼子浸泡10秒。将对照检查（CK）浸泡在0.2%溶剂（本研究中为丙酮）中。
注意：每个浓度处理有三个重复，每个重复由60个规定组成。通过选择均匀大小的供应，可以减少每种供应的剂量差异。 - 用农药处理规定前后测量农药溶液的体积。然后，计算每次处理中浸入的杀虫剂体积，包括60个质量规定（补充表1）。在无菌工作台上风干后，将规定放在带孔的单独离心管中（从步骤1.1开始）。
注：实验前，将装有规定的笼子放入农药溶液中，然后测量浸泡前后农药溶液的体积，以消除误差。 - 使用软刷将雌性幼虫单独转移到自然干燥的食品表面。
注意：一管一个幼虫。
5. 生长条件
- 将 挖掘芽孢 杆菌的幼虫在黑暗的生长室中饲养，相对湿度为65%-75%，25±2°C16。
6. 结果审查
- 急性致死毒性试验
- 将幼虫置于治疗和对照（CK）规定48小时后测量幼虫的死亡率。
注：死亡标准：当幼虫对轻度触摸没有反应时，使用软刷在黑光灯下22。采用黑光灯模拟幼虫的暗生长条件，避免光照对幼虫的影响。为了消除人为错误，还测量了对照组48小时后有或没有从规定中去除幼虫的死亡率。 - 在昆虫饲养试验48小时之前和之后称重60个供给物，以确定每个幼虫消耗的供给量。
- 根据每剂食用的百分比和每份配料中的农药含量，计算出每种幼虫消耗的每种浓度的农药剂量。
注：剂量计算的等式为23：
其中，D是每个幼虫消耗的农药剂量;W1是60级施用农药前的重量;W2是48小时后剩余的60个规定重量;V1为农药浸泡前的体积为60种;V2为农药浸泡后的体积为60个规定;C是农药的浓度。
- 将幼虫置于治疗和对照（CK）规定48小时后测量幼虫的死亡率。
- 亚致死毒性试验
- 在饲养试验前和14天治疗后称量幼虫，以确定幼虫体重增加。
- 在黑光灯下茧期间，每天观察 挖掘芽孢 杆菌，以测量幼虫的发育持续时间。
- 在以处理过的和CK的供应物喂养14天后，称量其余部分的食物，以计算摄入食物的消耗量和转化效率（ECI）24。
- 当对照蜜蜂长成成虫时，用小剪刀狙击茧，检查茧的数量。
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Representative Results
规定中常用农药、毒死蜱、吡虫啉、芬地非脲、磷、阿维菌素含量均小于对照组定量限量（0.01~0.02 mg kg-1）;这些结果排除了农药残留对每次处理的影响。评估对照组48 h后有或未从供应中去除幼虫的死亡率;结果显示没有显着差异（表1），表明存在轻微的人为错误。
在急性致死毒性试验（表2）中，规定浸泡在七种稀释的农药溶液（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4微克a.i.mL-1毒死蜱）和0.2%丙酮（作为对照组） 中。对数概率回归分析根据摄入的农药剂量（范围为0.0001-0.005μg a.i.mL-1）和处理48小时后幼虫的相应死亡率，评估了农药对漏斗草的中位致死剂量（LD 50值）。结果表明，毒死蜱对漏斗草幼虫的LD50值为0.001（0.001~0.002）μg a.i. Bee-1。
在亚致死毒性试验中，在毒死蜱的浸泡浓度为0.1、0.2、0.4和0.8 μg a.i.mL-1下，对漏斗螈的幼虫体重增加、发育持续时间、心电离度、消耗量和ECI进行了评价。采用协方差分析（ANCOVA）确定挖掘蜉的发展（除漏度外）和食物利用的处理相关变化。相比之下，初始供应质量被用作协变量。随着剂量的增加，处理中幼虫体重增加，消耗和ECI的指数值降低，在0.013μg蜜蜂-1毒死蜱中观察到相对于对照的最低值。相反，与对照处理相比，在0.016μg蜜蜂-1毒死蜱中观察到最延长的幼虫发育持续时间（图1）。
使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的最小显着差（LSD）测试评估毒死蜱对eclosion速率的影响。还进行了Pearson的相关性研究，分析了毒死蜱的摄入剂量与挖掘蜱的漏合速率之间的关系。 在这里，该分析的结果表明，治疗存在显着的负线性关系（R2 = 0.82，P = 0.03）。当摄入的剂量超过0.002μga.i.bee-1时，eclosion率比对照治疗中的剂量低得多（图2）。
图1：毒死蜱对挖掘蜱生长、发育和投饲的影响（A）、（C）、（D）：处理14天后;（二）：茧前对O.进行挖掘。不同小写字母表示P<0.05时处理间差异显著。每个数据点的数字与SD平均值，请单击此处查看此数字的放大版本。
图2：毒死蜱的摄入剂量与挖掘O.的闭合速率之间的关系。不同小写字母表示P<0.05时处理间差异显著;每个数据点的数字与SD平均值，请单击此处查看此数字的放大版本。
| 治疗 | 死亡率 | |
| 重复 | 意味 着 | |
| 去除幼虫 | 11.91% | 9.67% 一 |
| 7.63% | ||
| 9.46% | ||
| 无需去除幼虫 | 6.88% | 8.28% 一 |
| 7.37% | ||
| 10.59% | ||
表1：对照组48小时后有或未从规定中去除幼虫的死亡率。 相同的小写字母表示 在P <0.05处处理间差异无显著差异。
| 杀虫剂 | 坡度 ± SE | Df | χ2 （P） | LD50 （95% 置信区间） （微克蜜蜂−1） |
LD90 （95% CI） （μg a.i. bee−1） |
| 毒死蜱 | y=3.23+0.30x | 5 | 5.38 (0.37) | 0.001 (0.001-0.002) | 0.02 (0.012-0.038) |
表2：毒死蜱在 48小时处理后对漏斗毒杆菌的毒性。SE - 标准误差;Df - 自由度;χ2- 卡方值;CI - 机密间隔。
补充表1：每次处理中浸入的杀虫剂体积，包括60个质量规定。请按此下载此表格。
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Discussion
对于成年传粉媒介，有两种主要方法可以测量农药的生态毒性。一种是接触法，将农药施用于成虫的原胸;另一种是胃毒性法，其中用含有农药25，26的蜂蜜水喂养成年传粉者。近年来，人们发现挖掘蜉的授粉效果和宸死率相对较低27. 据推测，施用农药对幼虫生长发育的影响是主要原因之一。然而，关于农药对挖掘芽孢杆菌幼虫的毒性评估方法的报道很少。本研究通过对供应群众进行农药污染，提出了一种有效的农药对开挖蚴幼虫死亡率、生长发育和投饲的影响。
许多研究使用含有致死介质浓度的蔗糖溶液来评估农药对蜜蜂28，29，30的毒性。农药暴露于单独蜜蜂的主要途径是幼虫或成虫的摄入、接触和跨变异传播31。本研究的方法模拟了独居成年蜜蜂对田间含农药食品直接接触和觅食的反应。对于独居蜂幼虫，其反应是根据生物学特性以供给量中残留的农药为食。此外，暴露于田间供应的杀虫剂在被挖掘芽孢杆菌幼虫吃掉之前，会引起降解，挥发，传导到其他组织 。 因此，通过分析幼虫摄入的农药剂量来评估农药对 漏斗草 的生态毒性，比使用农药浓度浸泡更好。
这些规定在大小上有很大差异，这可能会对幼虫和成虫的数量产生重大影响。选择供应和雌性幼虫，以根据供应大小和巢内细胞位置将误差降至最低。此外，在通过上述方法进行筛选后，进一步选择了类似尺寸的规定。虽然这部分工作量比较大，但在本研究中，统计每只幼虫的粮食消费量和每种浓度的农药量至关重要。因此，可以准确计算农药的摄入量。田间施用后不同时间规定农药残留的后续工作，有助于指导成虫的放行时间，减少农药对出土蜀虫幼虫的不利影响。
毒死蜱对挖掘螈虫幼虫的致死率很高，这与在成年授粉媒介（Apis mellifera和Apis cerana）上报告的结果相似，32，33。可以看出，本研究方法可以预测农药对异径直肠杆菌幼虫的毒性。然而，以前的研究发现，低死亡率不是一种统一的应激反应，也不表明对授粉媒介有任何不利影响。例如，新烟碱类药物不足以引起蜜蜂的急性死亡34，但会损害嗅觉学习和记忆以及筑巢和聚集活动的能力35，36，37，38，39，40。因此，必须评估农药对挖掘草幼虫的慢性毒性，以便从人口学角度全面了解农药对传粉媒介的生态毒性。但该方法评估了挖掘草幼虫幼虫的体重增加、发育持续时间、摄食模式和诱发能力。没有评估成年后的飞行能力和繁殖力。
本研究仍有一些局限性。假设这些规定吸收了100%的浸入式解决方案。尽管如此，这一假设仍应通过分析加以验证，因为每种供应品的体积和湿度可能导致不同的浓度，这表明在按剂量报告毒性终点时，需要对摄入的食物和食品中使用的标称测试浓度进行验证。因此，今后仍需使用分析方法核实条款中的农药浓度。
综上所述，该方法将通过评估与死亡率，幼虫体重增加，发育持续时间，诱发能力和喂养模式相关的终点，帮助研究人员提高农药对孤独蜜蜂幼虫的生态风险。该技术可以通过生成与孤独蜜蜂幼虫有关的定量数据来潜在地提高农药使用的安全性，这些数据很难通过半田间和田间实验获得。利用这种技术可以更好地预测和减轻杀虫剂对孤独蜜蜂的不利影响。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
本研究由国家重点研发计划（2017YFD0200400）、重大科技创新项目（2017CXGC0214）、山东省蜜蜂产业创新团队、山东省农业科学院农业科技创新项目（CXGC2019G01）和山东省农业科学院农业科技创新项目（CXGC2021B13）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abamectin | Jinan Lvba Pesticide Co. Ltd | ||
| Black-light lamps | Kanghua Medical Device Co., Ltd | ||
| Centrifugal tube box with 100 Wells | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | ||
| Centrifuge tube | Shanghai Rebus Network Technology Co., Ltd | 2 mL; Serve as bee tube | |
| Electric soldering iron | Kunshan Kaipai Hardware Electromechanical Co., Ltd | ||
| Electronic scale | Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd | 3137510295 | |
| Graduated cylinder | Anhui Weiss Experimental Equipment Co. Ltd | ||
| Petri dishes (60 mm diameter) | Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD | ||
| Pollen provision | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd | ||
| Soft brush | Wengang Wenhai painting material factory | ||
| Solitary bees | Yantai Bifeng Agricultural Science and Technology Co. Ltd |
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