Brug phage display til at udvikle Ubiquitin Variant Modulatorer til E3 Ligases

Summary

Allestedsnærværende er et kritisk protein efter translationel modifikation, hvis dysregulering har været impliceret i mange menneskelige sygdomme. Denne protokol beskriver, hvordan phage display kan bruges til at isolere nye allestedsnærværende varianter, der kan binde og modulere aktiviteten af E3 ligaser, der styrer specificitet, effektivitet og mønstre af allestedsnærværende.

Abstract

Ubiquitin er et lille 8,6 kDa protein, der er en kernekomponent i ubiquitin-proteasome-systemet. Derfor kan det binde sig til en bred vifte af proteiner med høj specificitet, men lav affinitet. Gennem phage display, kan allestedsnærværende varianter (UbVs) manipuleres sådan, at de udviser forbedret affinitet over wildtype ubiquitin og opretholde bindende specificitet til at målrette proteiner. Phage display bruger en phagemid bibliotek, hvorved pIII pels protein af en filamentous M13 bakteriofage (valgt fordi det vises eksternt på phage overfladen) er smeltet sammen med UbVs. Specifikke rester af human wildtype ubiquitin er bløde og randomiserede (dvs. der er en bias i retning af indfødte wildtype sekvens) til at generere UbVs således, at skadelige ændringer i protein kropsbygning undgås samtidig indføre den mangfoldighed, der er nødvendig for at fremme nye interaktioner med målet protein. Under phage display proces, er disse UbVs udtrykkes og vises på phage coat proteiner og panoreret mod et protein af interesse. UbVs, der udviser gunstige bindende interaktioner med målet protein bevares, mens dårlige bindemidler vaskes væk og fjernes fra biblioteket pool. De bevarede UbVs, som er fastgjort til phage partikel, der indeholder UbV’s tilsvarende phagemid, er eluted, forstærket, og koncentreret, så de kan panoreres mod det samme mål protein i en anden runde af phage display. Typisk udføres op til fem runder phage display, hvor der pålægges et stærkt udvælgelsespres mod UbVs, der binder svagt og / eller promiskuitet, så dem med højere tilhørsforhold er koncentreret og beriget. I sidste ende er UbVs, der demonstrerer højere specificitet og / eller affinitet for målproteinet end deres wildtype kolleger, isolerede og kan karakteriseres gennem yderligere eksperimenter.

Introduction

Forståelse af de molekylære detaljer i protein-protein interaktioner er afgørende for afgrænsning af signaltransduktionsmekanismerne i biologiske processer, især dem, der bidrager til klinisk vigtige sygdomme. I de senere år er phage display blevet brugt som en praktisk og tilgængelig metode til at isolere proteiner / peptider med meget forbedret binding til et ønsket ^{målprotein1,2,3,4}, som igen kan bruges som intracellulære sonder af protein-protein interaktioner.

Allestedsnærværende er en kaskade af enzymatiske aktiviteter (E1 aktiverende enzym → E2 konjugaterende enzym → E3 ligaser), der kovalent konjugat ubiquitin (Ub) til protein substrater til at målrette dem til nedbrydning eller at mægle celle signalering ændringer. Derudover katalyserer deubiquitinaser fjernelsen af allestedsnærværende fra proteiner. Derfor er der i celler tusindvis af Ub-afhængige protein-protein interaktioner, hvoraf langt de fleste genkender en fælles overflade med lav affinitet, men høj specificitet for at tillade svage interaktioner gennem store og forskelligartede overflader.

Ernst et al. introducerede mutationer i kendte bindende områder af Ub for at se, om de kunne øge bindende affinitet for et protein af interesse, samtidig med at høj ^{selektivitet5} opretholdes. Et kombinatorisk bibliotek på over 10 milliarder (7,5 x ¹⁰¹⁰) Ub-varianter (UbVs) med mutationer på positioner på tværs af Ub-overfladen, der formidler de kendte Ub-protein interaktioner, blev udviklet. Dette bibliotek bestod af phagemids, der udtrykker M13 bakteriofage pIII pels protein smeltet til diversificerede UbVs. Derfor kan individuelle UbVs vises på phage overfladen via pelsproteinet ved udtryk. Under udvælgelsesprocessen vil phage, der viser UbVs med betydelige bindende interaktioner med målproteinet, blive bevaret og beriget i efterfølgende phage-display, mens phage, der viser UbVs, der binder sig dårligt til målproteinet, vaskes væk og fjernes fra phage-puljen. De bevarede phage partikler indeholder phagemid svarende til deres viste UbV, så de kan sekvenseres og yderligere karakteriseres, når de er isoleret.

Ved hjælp af denne protein engineering strategi, UbV hæmmere blev udviklet til menneskelige deubiquitinases5 og viral proteaser6. Vigtigere, vi har genereret hæmmende UbVs for menneskelige HECT-familie E3 ligaser gennem kapring af E2-bindende site og aktivering af UbVs, der indtager en Ub-bindende exosite på HECT ^domæne7. Vi kan også hæmme monomeriske RING-familie E3’ere ved at målrette E2-bindingsstedet og fremkalde UbV-dimerisering for at aktivere homodimerisk RING E3s8. For ring E3’er med flere underenheder kan UbVs opnå hæmning ved at målrette ring-underenheden (f.eks. for APC/C-kompleks9) eller forstyrre kompleks dannelse (f.eks. for SCF E3s10). Samlet set kan UbVs udnyttes til systematisk at afhøre protein-protein interaktioner i Ub-proteasome system (UPS), så vi bedre kan dechifrere biokemiske mekanismer af UPS enzymer og til at identificere og validere funktionelle steder for terapeutisk intervention.

Følgende protokol beskriver, hvordan man anvender en tidligere genereret phage vises UbV bibliotek til at målrette et protein af interesse, og hvordan man beriger UbV bindemidler, der interagerer med målet protein gennem successive runder af phage display.

Protocol

1. Reagens forberedelse PBS (fosfatbufferet saltvand): Bland 50 mL 10x PBS-opløsning med 450 mL ultrapur H2O. Steriliser ved filtrering og opbevares ved 4 °C eller stuetemperatur (~20-25 °C). 10% BSA (kvæg serum albumin): Tilsæt langsomt 1 g BSA til 7 mL ultrapure H2O og bland indtil de er helt opløst (ingen klumper). Fyld op med ultrapur H2O, indtil det endelige volumen er 10 mL. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved 4 °C. PB buffer (PBS supple…

Representative Results

Bindemidler fremstillet af phage display kan verificeres og analyseres på mange måder. Det anbefales først at fortsætte med at sekventere phage med primere, der flankerer den diversificerede indsats i phagemid biblioteket. Et ideelt phage display eksperiment vil vise en klar bias mod flere sekvenser (Figur 1). Andre sekvenser vil også være til stede, men med et lavere antal, der vises mere som baggrundsstøj. I det medfølgende eksempel, hvor phage display blev udført mellem allesteds…

Discussion

Som nævnt i trin 2.1 (proteinpræparat) kan en række metoder bruges til at vurdere proteinkoncentrationen, og hver vil have unikke fordele og ulemper baseret på det specifikke målprotein, der anvendes til phage-display. En kilde til detaljerede beskrivelser og protokoller for populære metoder er blevet leveret ^tidligere11.

Brug af phage bevaret af en tidligere runde af phage display som input til en efterfølgende runde beriger de gode bindemidler ved gradvist at f…

Materials

Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.