Faagdisplay gebruiken om ubiquitinevariatoren voor E3-ligases te ontwikkelen
Summary
Ubiquitinatie is een kritisch eiwit posttranslationele modificatie, waarvan ontregeling is betrokken bij tal van menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft hoe faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe ubiquitinevarianten te isoleren die de activiteit van E3-ligases kunnen binden en moduleren die de specificiteit, efficiëntie en patronen van ubiquitinatie regelen.
Abstract
Ubiquitine is een klein 8,6 kDa-eiwit dat een kerncomponent is van het ubiquitine-proteasoomsysteem. Bijgevolg kan het binden aan een breed scala aan eiwitten met een hoge specificiteit maar een lage affiniteit. Door middel van faagweergave kunnen ubiquitinevarianten (UbV’s) zo worden ontworpen dat ze een verbeterde affiniteit vertonen ten opzichte van wildtype ubiquitine en bindingsspecificiteit behouden voor doeleiwitten. Faagweergave maakt gebruik van een faagmid-bibliotheek, waarbij het pIII-coatingeiwit van een filamenteuze M13-bacteriofaag (gekozen omdat het extern op het faagoppervlak wordt weergegeven) wordt gefuseerd met UbV’s. Specifieke residuen van menselijk wildtype ubiquitine zijn zacht en gerandomiseerd (d.w.z. er is een voorkeur voor inheemse wildtypesequentie) om UbV’s te genereren, zodat schadelijke veranderingen in eiwitconformatie worden vermeden en tegelijkertijd de diversiteit wordt geïntroduceerd die nodig is voor het bevorderen van nieuwe interacties met het doeleiwit. Tijdens het faagweergaveproces worden deze UbV’s tot expressie gebracht en weergegeven op faaglaageiwitten en gepaneerd tegen een eiwit van belang. UUBV’s die gunstige bindingsinteracties met het doeleiwit vertonen, worden behouden, terwijl slechte bindmiddelen worden weggespoeld en uit de bibliotheekpool worden verwijderd. De bewaarde UbV’s, die zijn bevestigd aan het faagdeeltje dat de overeenkomstige faagmide van de UbV bevat, worden geëlueerd, versterkt en geconcentreerd, zodat ze in een andere faagronde tegen hetzelfde doeleiwit kunnen worden gepaneerd. Doorgaans worden maximaal vijf faagrondes uitgevoerd, waarbij een sterke selectiedruk wordt opgelegd aan UbV’s die zwak en/of promiscue binden, zodat degenen met hogere affiniteiten geconcentreerd en verrijkt zijn. Uiteindelijk worden UbV’s die een hogere specificiteit en /of affiniteit voor het doeleiwit aantonen dan hun wildtype-tegenhangers geïsoleerd en kunnen ze worden gekarakteriseerd door verdere experimenten.
Introduction
Het begrijpen van de moleculaire details van eiwit-eiwitinteracties is van cruciaal belang voor het afbakenen van de signaaltransductiemechanismen van biologische processen, met name die welke bijdragen aan klinisch belangrijke ziekten. In de afgelopen jaren is faagweergave gebruikt als een praktische en toegankelijke methode om eiwitten / peptiden te isoleren met een sterk verbeterde binding aan een gewenst doeleiwit1,2,3,4, dat op zijn beurt kan worden gebruikt als intracellulaire sondes van eiwit-eiwitinteracties.
Ubiquitinatie is een cascade van enzymatische activiteiten (E1 activerend enzym → E2-conjugaterend enzym → E3-ligases) die ubiquitine (Ub) covalent conjugeren aan eiwitsubstraten om ze te richten op afbraak of om celsignaleringsveranderingen te bemiddelen. Bovendien katalyseren deubiquitinasen de verwijdering van ubiquitine uit eiwitten. Daarom zijn er in cellen duizenden Ub-afhankelijke eiwit-eiwitinteracties, waarvan de overgrote meerderheid een gemeenschappelijk oppervlak herkent met een lage affiniteit maar hoge specificiteit om zwakke interacties door grote en diverse oppervlakken mogelijk te maken.
Ernst et al. introduceerden mutaties in bekende bindingsgebieden van Ub om te zien of ze de bindingsaffiniteit voor een interessant eiwit konden verbeteren met behoud van een hoge selectiviteit5. Een combinatorische bibliotheek van meer dan 10 miljard (7,5 x 1010) Ub-varianten (UbV’s) met mutaties op posities over het Ub-oppervlak die de bekende Ub-eiwitinteracties bemiddelen, werd ontwikkeld. Deze bibliotheek bestond uit faagmiden die het M13 bacteriofaag pIII-vachteiwit tot expressie brengen, gefuseerd met gediversifieerde UbV’s. Daarom kunnen individuele UbV’s bij expressie via het vachteiwit op het faagoppervlak worden weergegeven. Tijdens het selectieproces worden fagen met UbV’s met aanzienlijke bindingsinteracties met het doeleiwit behouden en verrijkt in volgende faagrondes, terwijl faag met UbV’s die slecht binden aan het doeleiwit worden weggespoeld en uit de faagpool worden verwijderd. De vastgehouden faagdeeltjes bevatten het faagmide dat overeenkomt met hun weergegeven UbV, waardoor ze kunnen worden gesequenced en verder kunnen worden gekarakteriseerd zodra ze zijn geïsoleerd.
Met behulp van deze eiwittechnologiestrategie werden UbV-remmers ontwikkeld voor menselijke deubiquitinasen5 en virale proteasen6. Belangrijk is dat we remmende UbV’s hebben gegenereerd voor menselijke HECT-familie E3-ligases door de E2-bindingsplaats te kapen en UbV’s te activeren die een Ub-bindende exosiet op het HECT-domein bezetten7. We kunnen ook monomere RING-familie E3’s remmen door ons te richten op de E2-bindingsplaats en UbV-dimerisatie induceren om homodimere RING E3s8 te activeren. Voor ring-E3’s met meerdere subeenheden kunnen UbV’s remming bereiken door zich te richten op de RING-subeenheid (bijvoorbeeld voor APC / C-complex9) of complexe vorming te verstoren (bijvoorbeeld voor SCF E3s10). Gezamenlijk kunnen UbV’s worden gebruikt om systematisch eiwit-eiwitinteracties in het Ub-proteasoomsysteem (UPS) te ondervragen, zodat we biochemische mechanismen van UPS-enzymen beter kunnen ontcijferen en functionele locaties voor therapeutische interventie kunnen identificeren en valideren.
Het volgende protocol beschrijft hoe een eerder gegenereerde faag weergegeven UbV-bibliotheek kan worden gebruikt om een eiwit van belang te targeten en hoe de UbV-bindmiddelen die interageren met het doeleiwit kunnen worden verrijkt door middel van opeenvolgende faagweergaverondes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals vermeld in stap 2.1 (eiwitpreparaat), kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de eiwitconcentratie te beoordelen, en elk zal unieke voor- en nadelen hebben op basis van het specifieke doeleiwit dat wordt gebruikt voor faagweergave. Een bron van gedetailleerde beschrijvingen en protocollen voor populaire methoden is eerder verstrekt11.
Het gebruik van de faag die door een vorige faagronde wordt vastgehouden als input voor een volgende ronde verrijkt de goe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ubiquitine variant technologie werd bedacht in het laboratorium van Dr. Sachdev Sidhu (Universiteit van Toronto). WZ is momenteel een CIFAR Azrieli Global Scholar in het Humans & The Microbiome Program. Dit onderzoek werd gefinancierd door NSERC Discovery Grants toegekend aan WZ (RGPIN-2019-05721).
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
References
- Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
- Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
- Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
- Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
- Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
- Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
- Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
- Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
- Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
- Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
- Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
- Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
- Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
- Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
- Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
- Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
- Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
- Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
- Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
- Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
- Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
- Reiersen, H., et al. Covalent antibody display–an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
- Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
- Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
- Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).
