Bruke Phage Display til å utvikle Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Summary

Allestedsnærværende er et kritisk protein post-translasjonell modifikasjon, hvorav dysregulering har vært involvert i mange menneskelige sykdommer. Denne protokollen beskriver hvordan phage display kan brukes til å isolere nye allestedsnærværende varianter som kan binde og modulere aktiviteten til E3 ligaer som styrer spesifisiteten, effektiviteten og mønstrene for allestedsnærværende.

Abstract

Ubiquitin er et lite 8,6 kDa protein som er en kjernekomponent i allestedsnærværende proteasomsystemet. Følgelig kan det binde seg til et mangfoldig utvalg av proteiner med høy spesifisitet, men lav affinitet. Gjennom phage display, allestedsnærværende varianter (UbVs) kan konstrueres slik at de viser forbedret affinitet over wildtype ubiquitin og opprettholde bindende spesifisitet til mål proteiner. Phage display benytter et phagemid bibliotek, hvorved pIII-frakkproteinet til en filamentøs M13 bakteriofage (valgt fordi den vises eksternt på phageoverflaten) er smeltet sammen med UbVs. Spesifikke rester av menneskelig wildtype ubiquitin er myke og randomiserte (dvs. det vil si at det er en skjevhet mot innfødt wildtype-sekvens) for å generere UbVs slik at skadelige endringer i proteinkonformasjon unngås mens du introduserer mangfoldet som er nødvendig for å fremme nye interaksjoner med målproteinet. Under phage display prosessen, disse UbVs uttrykkes og vises på phage frakk proteiner og panorert mot et protein av interesse. UbVs som viser gunstige bindende interaksjoner med målproteinet beholdes, mens dårlige bindemidler vaskes bort og fjernes fra biblioteksbassenget. De beholdte ubvene, som er festet til phage-partikkelen som inneholder UbVs tilsvarende phagemid, blir elutert, forsterket og konsentrert slik at de kan panoreres mot det samme målproteinet i en annen runde med phage-skjerm. Vanligvis utføres opptil fem runder med phage-skjerm, hvor et sterkt utvalgstrykk pålegges ubvs som binder seg svakt og / eller promiskuøst slik at de med høyere affiniteter konsentreres og berikes. Til syvende og sist er UbVs som demonstrerer høyere spesifisitet og / eller affinitet for målproteinet enn deres wildtype-kolleger isolert og kan karakteriseres gjennom ytterligere eksperimenter.

Introduction

Forståelse av molekylære detaljer om proteinproteininteraksjoner er avgjørende for å avgrense signaltransduksjonsmekanismene til biologiske prosesser, spesielt de som bidrar til klinisk viktige sykdommer. De siste årene har phage display blitt brukt som en praktisk og tilgjengelig metode for å isolere proteiner / peptider med mye forbedret binding til et ønsket målprotein1,2,3,4, som igjen kan brukes som intracellulære sonder av proteinproteininteraksjoner.

Allestedsnærværende er en kaskade av enzymatiske aktiviteter (E1 aktiverende enzym → E2 konjugaterende enzym → E3 ligaer) som kovalent konjugerer allestedsnærværende (Ub) til protein substrater for å målrette dem for nedbrytning eller for å megle cellesignalering endringer. I tillegg katalyserer deubiquitinases fjerning av ubiquitin fra proteiner. Derfor, i celler, er det tusenvis av Ub-avhengige proteinproteininteraksjoner, hvorav de aller fleste gjenkjenner en felles overflate med lav affinitet, men høy spesifisitet for å tillate svake interaksjoner gjennom store og forskjellige overflater.

Ernst et al. introduserte mutasjoner i kjente bindende regioner i Ub for å se om de kunne forbedre bindende affinitet for et protein av interesse samtidig som de opprettholder høy ^{selektivitet5}. Et kombinatorisk bibliotek med over 10 milliarder (7,5 x ¹⁰¹⁰) Ub-varianter (UbVs) med mutasjoner i posisjoner over hele Ub-overflaten som formidler de kjente Ub-proteininteraksjonene ble utviklet. Dette biblioteket besto av phagemids som uttrykker M13 bakteriofage pIII frakkprotein smeltet til diversifiserte ubVs. Derfor kan individuelle UbVs vises på phage overflaten via frakkproteinet ved uttrykk. Under utvelgelsesprosessen vil phage som viser UbVs med betydelige bindende interaksjoner med målproteinet bli beholdt og beriket i påfølgende runder med phage display, mens phage viser UbVs som binder dårlig til målproteinet vaskes bort og fjernes fra phage bassenget. De beholdte phagepartiklene inneholder phagemid som tilsvarer deres viste UbV, slik at de kan sekvenseres og ytterligere karakteriseres når de er isolert.

Ved hjelp av denne proteinteknologistrategien ble UbV-hemmere utviklet for humane deubiquitinases5 og virale proteaser6. Viktigst av alt, vi har generert hemmende ubVs for humane HECT-familie E3 ligaer gjennom kapring av E2-bindende nettstedet og aktivere UbVs som opptar en Ub-bindende exosite på HECT-domenet7. Vi kan også hemme monomeriske RING-familie E3-er ved å målrette E2-bindingsstedet og indusere UbV-dimmerisering for å aktivere homodimerisk RING E3s8. For ring E3-er med flere underenheter kan ubVer oppnå hemming ved å målrette mot RING-underenheten (f.eks. for APC/C-kompleks9) eller forstyrre kompleks formasjon (f.eks. for SCF E3s10). Samlet kan ubvs utnyttes til systematisk å forhøre proteinproteininteraksjoner i Ub-proteasome-systemet (UPS) slik at vi bedre kan dechiffrere biokjemiske mekanismer for UPS-enzymer og for å identifisere og validere funksjonelle steder for terapeutisk inngrep.

Følgende protokoll beskriver hvordan du bruker et tidligere generert phage som vises UbV-biblioteket for å målrette mot et protein av interesse og hvordan du beriker UbV-bindemidlene som samhandler med målproteinet gjennom påfølgende runder med phage-visning.

Protocol

1. Reagens forberedelse PBS (fosfatbufret saltvann): Bland 50 ml 10x PBS-oppløsning med 450 ml ultrarent H2O. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C eller romtemperatur (~20-25 °C). 10% BSA (bovint serumalbumin): Tilsett sakte 1 g BSA til 7 ml ultrapure H2O og bland til det er fullstendig oppløst (ingen klumper). Fyll på med ultrapure H2O til det endelige volumet er 10 ml. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C. PB-buffer (PBS supplert m…

Representative Results

Dokumentordnere produsert fra phage display kan verifiseres og analyseres på mange måter. Det anbefales først å fortsette med sekvensering av phage med primere som flankerer den diversifiserte innsatsen i phagemid-biblioteket. Et ideelt phage display eksperiment vil vise en klar skjevhet mot flere sekvenser (figur 1). Andre sekvenser vil også være til stede, men med en lavere telling, som vises mer som bakgrunnsstøy. I eksemplet som ble gitt, hvor phage display ble utført mellom alle…

Discussion

Som nevnt i trinn 2.1 (proteinpreparat), kan en rekke metoder brukes til å vurdere proteinkonsentrasjonen, og hver vil ha unike fordeler og ulemper basert på det spesifikke målproteinet som brukes til phage display. En kilde til detaljerte beskrivelser og protokoller for populære metoder har blitt gitt ^tidligere11.

Ved å bruke phage beholdt av en tidligere runde av phage display som inngang for en etterfølgende runde beriker de gode bindemidler ved gradvis å fjer…

Materials

Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.