Staartaderdoorsnede bloeden model bij volledig verdoofde hemofilie A muizen
Summary
Het refined tail vein transection (TVT) bloedingsmodel bij verdoofde muizen is een gevoelige in vivo methode voor de beoordeling van hemofiele bloedingen. Dit geoptimaliseerde TVT-bloedingsmodel gebruikt bloedverlies en bloedingstijd als eindpunten, verfijnt andere modellen en vermijdt de dood als eindpunt.
Abstract
Staartbloedingsmodellen zijn belangrijke hulpmiddelen in hemofilieonderzoek, met name voor de beoordeling van procoagulante effecten. Het overlevingsmodel voor staartaderdoorsnede (TVT) heeft in veel omgevingen de voorkeur gekregen vanwege de gevoeligheid voor klinisch relevante doses FVIII, terwijl andere gevestigde modellen, zoals het staartclipmodel, hogere niveaus van procoagulante verbindingen vereisen. Om overleving als eindpunt te vermijden, hebben we een TVT-model ontwikkeld dat bloedverlies en bloedingstijd als eindpunten en volledige anesthesie tijdens het hele experiment vaststelt. In het kort worden verdoofde muizen geplaatst met de staart ondergedompeld in een gematigde zoutoplossing (37 °C) en gedoseerd met de teststof in de rechter laterale staartader. Na 5 minuten wordt de linker laterale staartader getransecteerd met behulp van een sjabloongeleider, wordt de staart teruggebracht naar de zoutoplossing en worden alle bloedingsepisoden gedurende 40 minuten gevolgd en geregistreerd tijdens het verzamelen van het bloed. Als er geen bloeding optreedt na 10 minuten, 20 minuten of 30 minuten na het letsel, wordt het stolsel voorzichtig uitgedaagd door de snee twee keer af te vegen met een nat gaasje. Na 40 minuten wordt het bloedverlies gekwantificeerd door de hoeveelheid hemoglobine die in de zoutoplossing bloedt. Deze snelle en relatief eenvoudige procedure resulteert in consistente en reproduceerbare bloedingen. In vergelijking met het TVT-overlevingsmodel gebruikt het een meer humane procedure zonder afbreuk te doen aan de gevoeligheid voor farmacologische interventie. Bovendien is het mogelijk om beide geslachten te gebruiken, waardoor het totale aantal dieren dat moet worden gefokt, wordt verminderd, in overeenstemming met de principes van 3R’s. Een mogelijke beperking in bloedingsmodellen is de stochastische aard van hemostase, die de reproduceerbaarheid van het model kan verminderen. Om dit tegen te gaan, zorgt handmatige stolselverstoring ervoor dat het stolsel tijdens de monitoring wordt uitgedaagd, waardoor primaire (bloedplaatjes) hemostase het bloeden stopt. Deze toevoeging aan de catalogus van bloedingsletselmodellen biedt een optie om procoagulante effecten op een gestandaardiseerde en humane manier te karakteriseren.
Introduction
Diermodellen zijn essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van hemofilie en het ontwikkelen en testen van behandelingsregimes en therapieën. De Factor VIII knock-out muis (F8-KO) is een veelgebruikt model voor de studie van hemofilie A 1,2. Deze muizen recapituleren de belangrijkste kenmerken van de ziekte en zijn op grote schaal gebruikt voor de ontwikkeling van behandelingen, zoals recombinante FVIII-producten 3,4,5 en gentherapiestrategieën 6,7.
Er zijn verschillende bloedingsletselmodellen voor het evalueren van de farmacologische effecten van verschillende hemostatische verbindingen in vivo. Een van deze stollingsmodellen is het overlevingsmodel voor staartadertranssectie bij muizen 8,9,10,11,12,13,14, dat het vermogen van hemofiele muizen meet om exsanguinatie na staarttranssectie te overleven. Deze methode werd meer dan vier decennia geleden15 jaar geleden geïntroduceerd en wordt nog steeds 9,16,17 gebruikt. Het model gebruikt echter overleving als eindpunt en vereist observatie van de dieren gedurende een periode van maximaal 24 uur, waarbij de dieren bij bewustzijn zijn en dus pijn en angst kunnen ervaren.
Bloedingsmodellen van kortere duur en onder volledige anesthesie zijn eerder beschreven, zoals het staartclipmodel (ook bekend als de staartpunt)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Niettemin, voor een volledige normalisatie van bloedverlies na de bloedingsuitdaging, vereisen deze modellen doses procoagulantia (bijv. FVIII) die veel hoger zijn dan die welke klinisch worden toegediend29. Een ander letselmodel onder anesthesie, de vena saphena-bloedingsmethode, is gevoelig voor lagere doses procoagulante verbindingen30, maar vereist een hoog niveau van experimentele interventie omdat de stolsels vaak moeten worden verstoord (in tegenstelling tot 3 keer in het gepresenteerde model).
Standaardisatie naar een gemeenschappelijk protocol voor het testen van nieuwe procoagulante verbindingen zou de gegevensvergelijking tussen laboratoria aanzienlijk vergemakkelijken 31,32,33. In TVT-modellen is er nog geen overeenstemming over bestudeerde eindpunten (bloedverlies 7,26, bloedingstijd 9,34 en overlevingspercentage35,36), en de experimentele lengte varieert tussen studies13.
Ons primaire doel is om een geoptimaliseerd model te beschrijven en te karakteriseren met een hoge reproduceerbaarheid, de mogelijkheid om on-demand te bestuderen, evenals een profylactische behandeling, gevoeligheid voor farmacologische interventie gelijkwaardig aan het overlevingsmodel, maar zonder dood of bijna-dood als eindpunten te gebruiken. Om pijn en angst te verminderen, mogen de dieren niet bij bewustzijn zijn tijdens het bloeden en moet een ethischer eindpunt worden geïmplementeerd37.
Staartclipmodellen worden over het algemeen uitgevoerd in een van de twee varianten, ofwel het amputeren van de punt van de staart, bijvoorbeeld amputatie van 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 of, in een meer ernstige variant, getranseceerd bij een staartdiameter rond 1-3 mm 8,22,25 . Dit veroorzaakt een gecombineerde arterioveneuze bloeding, omdat de laterale en dorsale aderen en ventrale slagader meestal worden doorgesneden, en in het algemeen, hoe groter de amputatie, hoe lager de gevoeligheid voor een procoagulante verbinding. Bovendien, omdat de staartpunt wordt geamputeerd, wordt de arterioveneuze verwonding blootgesteld zonder enig tegengesteld weefsel; dus, althans in theorie, is het anders dan de meest voorkomende hemofiele bloedingen.
Zoals de naam al aangeeft, is alleen de ader gewond in staartadertranssectiemodellen zoals beschreven in dit artikel, wat resulteert in een uitsluitend veneuze bloeding. Omdat het vat niet volledig is afgebroken, zal het letsel naar verwachting kleiner zijn dan in de amputatiemodellen en blijft het weefsel rond de snee, waaraan een stolsel zich kan hechten, behouden. Bovendien is er een lagere bloeddruk in de ader in tegenstelling tot de slagader. Deze factoren dragen bij aan een verhoogde gevoeligheid ten opzichte van amputatiemodellen, zodat normalisatie van bloedingen kan worden bereikt met klinisch relevante doses vervangingstherapie, bijvoorbeeld met rFVIII bij hemofilie A, wat nuttig is voor het evalueren van de omvang en duurzaamheid van effecten van procoagulante behandeling 26,38,39.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze geoptimaliseerde methode van staartaderdoorsnede (TVT) heeft verschillende voordelen ten opzichte van de TVT-overlevingsmethode. De dieren worden volledig verdoofd voor de gehele duur van het onderzoek, wat het hanteren van muizen gemakkelijker maakt en het welzijn van de dieren verhoogt. Verder is, in tegenstelling tot het TVT-overlevingsmodel, nachtelijke observatie niet vereist, en dit geoptimaliseerde model biedt de mogelijkheid om bloedverlies te meten en de exacte bloedingstijd gedurende 40 minuten te observer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esther Bloem en Thomas Nygaard worden erkend voor ondersteuning bij metingen van FVIII in plasma. Bo Alsted is erkend voor het tekenen en bewerken van de sjabloon en het snijden van blokken.
Materials
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
- Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
- Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
- Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
- Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
- Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
- Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
- Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
- Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
- Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
- Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
- Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
- Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
- Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
- Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
- Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II – A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
- Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
- Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
- Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
- Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
- Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
- Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
- Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
- Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
- Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
- Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
- Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice – characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
- Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
- Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
- Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, 101-108 (2003).
- Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
- Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
- Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
- Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
- Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
- Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
- Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
- Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
- Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
- Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
- Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J. Haemophilias A and B. Lancet. 361 (9371), 1801-1809 (2003).
- Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
- Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
- Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
- Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
- Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
- Kawecki, C., et al. Posters Abstracts – Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
- Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
- Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).
