完全麻酔血友病Aマウスにおける尾静脈切除出血モデル
1Global Drug Discovery,Novo Nordisk A/S, 2Department of Veterinary and Animal Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 3Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 4Independent consultant, 5Catalyst Biosciences, 6Værløse Dyreklinik
Summary
麻酔をかけたマウスにおける精製尾静脈切除(TVT)出血モデルは、血友病出血の評価のための敏感な in vivo 法である。この最適化されたTVT出血モデルは、失血と出血時間をエンドポイントとして使用し、他のモデルを改良し、死亡をエンドポイントとして回避します。
Abstract
尾出血モデルは、血友病研究、特に凝固促進効果の評価において重要なツールである。尾静脈切断(TVT)生存モデルは、臨床的に関連する用量のFVIIIに対する感受性のために多くの設定で好まれてきたが、テールクリップモデルなどの他の確立されたモデルは、より高いレベルの凝固促進化合物を必要とする。生存をエンドポイントとして使用しないようにするために、我々は失血と出血時間をエンドポイントとして確立し、実験全体を通して完全な麻酔を確立するTVTモデルを開発しました。簡単に説明すると、麻酔をかけたマウスは、尾部を温食塩水(37°C)に沈めて位置決めし、右側尾静脈に試験化合物を投与する。5分後、テンプレートガイドを使用して左側尾静脈をトランスセクトし、尾を生理食塩水に戻し、血液を採取しながらすべての出血エピソードを40分間監視および記録する。傷害後10分、20分、または30分で出血が起こらない場合、湿ったガーゼ綿棒で切り傷を2回拭くことによって血餅に優しく挑戦する。40分後、失血は生理食塩水に採血されたヘモグロビンの量によって定量化される。この迅速かつ比較的簡単な手順は、一貫性のある再現性のある出血をもたらす。TVT生存モデルと比較して、薬理学的介入に対する感受性を損なうことなく、より人道的な手順を使用する。さらに、3Rの原則に従って、繁殖する必要がある動物の総数を減らして、両方の性別を使用することが可能です。出血モデルにおける潜在的な制限は、止血の確率的性質であり、モデルの再現性を低下させる可能性がある。これに対抗するために、手動血餅破壊は、モニタリング中に血餅が挑戦されることを保証し、原発性(血小板)止血が出血を止めるのを防ぎます。出血傷害モデルのカタログへのこの追加は、標準化された人道的な方法で凝固促進効果を特徴付けるオプションを提供する。
Introduction
動物モデルは、血友病の病因を理解し、治療レジメンおよび治療法を開発および試験するために不可欠である。第VIII因子ノックアウトマウス(F8-KO)は、血友病A 1,2の研究に広く使用されているモデルである。これらのマウスは、疾患の主要な特徴を再現し、組換えFVIII産物3、4、5および遺伝子治療戦略6、7などの治療法の開発に広く使用されている。
インビボで異なる止血化合物の薬理学的効果を評価するための様々な出血傷害モデルがある。これらの凝固モデルの1つは、マウス8、9、10、11、12、13、14における尾静脈切除生存モデルであり、尾部離反後に放血を生き延びる血友病マウスの能力を測定する。この方法は40年以上前に導入され15、現在も9,16,17で使用されています。しかし、このモデルは生存をエンドポイントとして利用し、動物が意識的であり、したがって痛みや苦痛を経験することができる最大24時間にわたって動物の観察を必要とする。
テールクリップモデル(テールチップとしても知られている)8、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28など、より短い持続時間および完全麻酔下の出血モデルは、以前に説明されている.それにもかかわらず、出血チャレンジ後の失血の完全な正常化のためには、これらのモデルは、臨床的に投与されたものよりもはるかに高い用量の凝固促進化合物(例えば、FVIII)を必要とする29。麻酔下での別の傷害モデルである大静脈サフェナ出血法は、低用量の凝固促進剤化合物30に感受性であるが、血餅を頻繁に破壊しなければならないため(提示されたモデルでは3回とは対照的に)、高レベルの実験者の介入が必要である。
新しい凝固促進剤化合物を試験するための共通プロトコールに向けた標準化は、実験室間のデータ比較を大いに容易にするであろう31、32、33。TVTモデルでは、研究されたエンドポイント(失血7,26、出血時間9,34、生存率35,36)に関する共通の合意はまだなく、実験の長さは研究間で異なる13。
私たちの主な目的は、高い再現性、オンデマンドおよび予防的治療の研究の可能性、生存モデルと同等の薬理学的介入に対する感受性、それでも死亡または臨死をエンドポイントとして使用しない最適化されたモデルを記述し、特徴付けることです。痛みや苦痛を軽減するために、動物は出血中に意識を持つべきではなく、より倫理的なエンドポイントを実装する必要があります37。
テールクリップモデルは、一般に、尾の先端を切断するか、例えば、1〜5mmの切断、例えば、1〜5mmの切断、1〜5mmの切断、1〜3mmの切断、またはより重篤な変形では、尾の直径約1〜3mmの8,22,25でトランセクトする2つの変形のいずれかで実施される。.これは、側静脈および背静脈および腹側動脈が通常切断されるため、複合動静脈出血を引き起こし、一般に、切断が大きいほど、凝固促進剤化合物に対する感受性を低下させる。さらに、尾先が切断されるので、動静脈損傷は、任意の反対の組織なしで露出する。したがって、少なくとも理論的には、最も一般的な血友病出血とは異なっている。
名前が示すように、この論文に記載されているような尾静脈切断モデルでは静脈のみが損傷し、したがって排他的に静脈出血をもたらす。血管は完全に切断されていないため、損傷は切断モデルよりも小さいと予想され、血餅が付着する可能性のある切断の周囲の組織は保持される。さらに、動脈とは対照的に静脈の血圧が低い。これらの因子は、切断モデルに対する感受性の増加に寄与し、その結果、臨床的に関連する用量の補充療法、例えば血友病AにおけるrFVIIIを用いて出血の正常化を達成することができ、これは凝固促進剤治療の効果の大きさおよび持続性を評価するのに有用である26,38,39。
Protocol
この議定書に記載されているすべての手順は、Novo Nordisk A/Sの動物福祉機関、およびデンマーク食品農業水産省のデンマーク動物実験検査官によって承認されています。最適化された40分の方法には、麻酔と投与時間が設計に含まれています(図1)。この手順には、10〜16週齢の両性の血友病マウスが必要である。 1. 学習前の準備 正しい濃度で?…
Representative Results
最適化されたモデルの適用性を評価するために、市販の組換え第VIII因子補充療法(rFVIII)を投与したF8−KO(C57BL遺伝的背景)マウスにおいて研究を実施した。1IU/kg、5IU/kg、10IU/kg、および20IU/kgの4つの異なる用量が試験された。さらに、陽性対照群としてC57BLマウスを用いたF8-KOマウスおよび野生型(WT)群における対応するビヒクル(陰性)対照を試験し、モデルにおける応答範囲を評価した。 <p class…
Discussion
尾静脈切断(TVT)のこの最適化された方法は、TVT生存法と比較していくつかの利点を有する。動物は研究期間全体にわたって完全に麻酔をかけられるため、マウスの取り扱いが容易になり、動物の健康が向上します。さらに、TVT生存モデルとは異なり、一晩の観察は必要なく、この最適化されたモデルは、失血を測定し、40分にわたって正確な出血時間を観察する可能性を提供する。また、意識…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esther BloemとThomas Nygaardは、血漿中のFVIIIの測定を支持して認められています。Bo Alstedは、テンプレートの描画と加工、およびブロックの切断で認められています。
Materials
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
References
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Cite This Article
Carol Illa, A., Baumgarten, S., Danielsen, D., Larsen, K., Elm, T., Johansen, P. B., Knudsen, T., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ley, C. D. Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice. J. Vis. Exp. (175), e62952, doi:10.3791/62952 (2021).