単純ヘルペスウイルスのプラーキング
Summary
プラーキングは、集団内の生きたウイルスを定量化するために使用される日常的な方法です。プラーキングは、細菌やバクテリオファージを用いたさまざまな微生物学のカリキュラムで頻繁に教えられていますが、哺乳類ウイルスのプラーキングはより複雑で時間がかかります。このプロトコルは、単純ヘルペスウイルスとの定期的な作業のために確実に機能する手順を説明しています。
Abstract
ウイルスをプラクシングするための多数の公開されたプロトコルがあり、方法論に関する一次文献内の参考文献を含む。しかし、ウイルスのプラーキは実行が難しく、その仕様と改良に焦点を当てる必要があります。これは、主に最も細かい細部に細心の注意を払わなければならないため、新入生が習得するのに信じられないほど挑戦的な方法です。単純ヘルペスウイルスをプラキューイングするこのデモンストレーションは、長年にわたってこの方法、特にそのニュアンスを視覚化するのに苦労してきた人々を助けるはずです。この原稿は標準的なプラーキング方法論の同じ原則に基づいていますが、(1)プロセス中の破壊を避けるために宿主細胞を処理する最善の方法、(2)ビリオンの拡散を制限するためにアガロースよりも有用な粘性媒体、および(3)確実に再現可能な結果をもたらす簡単な固定および染色手順の詳細な説明が含まれている点で異なります。さらに、添付のビデオは、プラークアッセイの実施を他の人に指示するときにしばしば見逃されるプロセスのより細かい区別を実証するのに役立ちます。
Introduction
ウイルスプラークアッセイの始まりは、1890年代のウイルスの最初の発見にさかのぼります1。タバコモザイクウイルスは最初に分離され、タバコの葉に伝染し、そこでは個々の感染スポットが単一の生きたウイルス実体2に由来すると認識され、定量化され、後にビリオン2として同定された。その後のバクテリアとバクテリオファージを用いた精力的な研究は、増殖の中間対数段階の細菌、バクテリオファージサンプルの段階希釈、および細菌芝生の文字通りの穴(プラークと名付けられた)のその後の視覚化を伴う上部寒天を含む、これらのウイルスをプラークするために使用される技術を完成させました3。
動物ウイルスのプラークは、主に培養中の哺乳類細胞を増殖させるために必要な方法が1940年代まで開発されなかったため、バクテリオファージで行われているエキサイティングな研究に遅れをとっていました4。しかし、宿主生物全体の存在下でマウス細胞が増殖する出現4は、ウイルスを培養し数える能力に新しい時代を生み出しました。このような研究は、ニワトリ細胞におけるウマ頭脳脊髄炎ウイルスおよびヒト細胞におけるポリオウイルスの増殖および定量のために拡張された5,6。培養可能な哺乳類細胞の領域が拡大するにつれて、さまざまなウイルス感染のためのさまざまな宿主細胞の群れは、あらゆる種類のウイルスを研究する可能性の宝庫を世界に与えました7。これには、ヒトヘルペスウイルス、特に皮膚粘膜病変を引き起こす単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)および-2(HSV-2)の増殖および定量化が含まれていた8。重要なことに、すべてのプラークアッセイは、サンプル中の受容体媒介性様式で宿主細胞に入ることができる生ビリオンの存在に依存している9。プラークアッセイの実行に関する遍在性および多数の出版物5,10,11,12,13,14,15,16にかかわらず、HSV-1/-2のためのこれらの方法は、芸術と科学の両方の混合物である。プロトコルのあらゆる細部に適切な注意を払わずにアッセイを行うことはできませんし、プロセスの微妙さに対する批判的な目なしでアッセイを成功させることもできません。この原稿は、HSV-1/-2プラークアッセイのための最も一貫して再現可能な方法の1つを描いており、アッセイの技術分野に関する正確な詳細はほとんど議論されていない。
この現在のプロトコルは、HSV-1および-2の生プラーク形成単位(PFU)数を確実に取得します。最良の結果は、低継代時(継代番号155以下)でVero細胞(形質転換アフリカミドリザル腎臓上皮細胞)を使用し、10%ウシ胎児血清(FCS)、L-アラニル-L-グルタミン、および抗生物質/抗真菌剤混合物を添加したα-MEM17で日常的に増殖させることです18。Vero細胞は、この培地中で週に2〜3回、毎回1/5希釈で標準的に増殖される。
Protocol
Representative Results
Discussion
プラークアッセイは哺乳類細胞培養自体とほぼ同じくらい古いものですが、各ラボにはこの基本的なアッセイを実行するための独自のプロトコルセットがあるようです5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、これらの方法を洗練させるために長年にわたって私たちと一緒に働いてきた私たちの研究室(PJDとBJM)の数え切れないほどの学生に感謝します。この方法論が最初に開発されたスタン・パーソンの指導に感謝します。この研究は、タウソン大学フィッシャー・カレッジ・オブ・サイエンス・アンド・マス学部研究支援基金とNIGMSブリッジズ・トゥ・バカロレア助成金5R25GM058264によって部分的に支援されました。このコンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の国立一般医学研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
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