Plaqueing من فيروسات الهربس البسيط
Summary
الترقيع هو طريقة روتينية تستخدم لتحديد كمية الفيروسات الحية في السكان. على الرغم من أن الترويح يتم تدريسه في كثير من الأحيان في مختلف مناهج علم الأحياء الدقيقة مع البكتيريا والعاثيات البكتيرية ، إلا أن ترقيع فيروسات الثدييات أكثر تعقيدا ويستغرق وقتا طويلا. يصف هذا البروتوكول الإجراءات التي تعمل بشكل موثوق للعمل المنتظم مع فيروسات الهربس البسيط.
Abstract
هناك العديد من البروتوكولات المنشورة لتصحيح الفيروسات ، بما في ذلك المراجع ضمن الأدبيات الأولية للمنهجية. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ فيروسات الترقيح ، مما يتطلب التركيز على مواصفاتها وصقلها. إنها طريقة صعبة بشكل لا يصدق للطلاب الجدد لإتقانها ، ويرجع ذلك أساسا إلى أنها تتطلب اهتماما دقيقا بأدق التفاصيل. يجب أن يساعد هذا العرض التوضيحي لفيروسات الهربس البسيط أولئك الذين كافحوا في تصور الطريقة ، وخاصة الفروق الدقيقة فيها ، على مر السنين. في حين أن هذه المخطوطة تستند إلى نفس مبادئ منهجية الترقيم القياسية ، إلا أنها تختلف في أنها تحتوي على وصف مفصل ل (1) أفضل طريقة للتعامل مع الخلايا المضيفة لتجنب الاضطراب أثناء العملية ، (2) وسط لزج أكثر فائدة من الأغاروز للحد من انتشار الفيروسات ، و (3) إجراء تثبيت وتلطيخ بسيط ينتج عنه نتائج قابلة للتكرار بشكل موثوق. علاوة على ذلك ، يساعد الفيديو المصاحب في إظهار الفروق الدقيقة في العملية ، والتي غالبا ما يتم تفويتها عند توجيه الآخرين حول إجراء اختبارات اللويحات.
Introduction
تعود بدايات فحوصات لوحة الفيروسات إلى الاكتشافات الأولى للفيروسات في 1890s1. تم عزل فيروس فسيفساء التبغ لأول مرة ونقله على أوراق التبغ، حيث يمكن التعرف على بقع العدوى الفردية وتحديدها كميا على أنها ناشئة عن كيان واحد من الفيروسات الحية2، والذي تم تحديده لاحقا على أنه فيروس2. وقد أتقنت الدراسات المنوية اللاحقة التي أجريت على البكتيريا والعاثيات البكتيرية التقنيات المستخدمة لتجويف هذه الفيروسات، بما في ذلك البكتيريا في مرحلة منتصف سجل النمو، والتخفيف التسلسلي لعينات العاثيات البكتيرية، والأجار العلوي مع التصور اللاحق للثقوب الحرفية (المسماة اللويحات) في العشب البكتيري3.
تأخر تراكم الفيروسات الحيوانية عن الأبحاث المثيرة التي تجرى مع العاثيات البكتيرية ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن الطرق اللازمة لزراعة خلايا الثدييات في الثقافة لم يتم تطويرها حتى 1940s4. ومع ذلك، فإن ظهور خلايا الفئران المتنامية في غياب الكائن الحي المضيف بأكمله4 ولد حقبة جديدة في القدرة على زراعة الفيروسات وعدها. وقد تم توسيع نطاق هذا العمل من أجل انتشار وقياس فيروس التهاب الدماغ والنخاع الخيلي الغربي في خلايا الدجاج وفيروس شلل الأطفال في الخلايا البشرية5،6. ومع توسع عالم خلايا الثدييات القابلة للاستزراع، أعطى وجود مجموعة من الخلايا المضيفة المختلفة لمختلف أنواع العدوى الفيروسية العالم وفرة من الاحتمالات لدراسة جميع أنواع الفيروسات7. وشمل ذلك انتشار فيروسات الهربس البشرية وتحديدها كميا، ولا سيما فيروس الهربس البسيط-1 (HSV-1) و-2 (HSV-2)، اللذين يسببان آفات مخاطية جلدية8. الأهم من ذلك ، أن جميع اختبارات البلاك تعتمد على وجود فيروسات حية ، والتي يمكن أن تدخل الخلايا المضيفة بطريقة بوساطة المستقبلات في عينة9. بغض النظر عن انتشار وتعدد المنشورات حول تنفيذ فحوصات اللويحات5،10،11،12،13،14،15،16 ، فإن هذه الطرق ل HSV-1/-2 هي مزيج من كل من الفن والعلم. لا يمكن للمرء إجراء الفحص دون الاهتمام المناسب بكل التفاصيل في البروتوكول ، ولا يمكن للمرء أن ينفذ فحصا ناجحا دون عين مكررة للدقة في هذه العملية. تصور هذه المخطوطة واحدة من أكثر الطرق القابلة للتكرار باستمرار لمقايسات لوحة HSV-1/-2 ، مع تفاصيل دقيقة حول فن الفحص نادرا ما تتم مناقشتها.
يحصل هذا البروتوكول الحالي على وحدات تشكيل البلاك الحية (PFU) لوحدات HSV-1 و -2 بشكل موثوق. يتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام خلايا Vero (الخلايا الظهارية الكلوية للقرد الأخضر الأفريقي) عند مرور منخفض (أسفل رقم الممر 155) وتزرع بشكل روتيني في alpha-MEM17 مع استكمال مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS) ، L-alanyl-L-glutamine ، وخليط مضاد حيوي / مضاد للفطريات 18. يتم نشر خلايا Vero بشكل قياسي في هذا الوسط مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع عند تخفيف 1/5 في كل مرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن مقايسات البلاك قديمة قدم زراعة خلايا الثدييات نفسها تقريبا ، يبدو أن كل مختبر لديه مجموعة خاصة به من البروتوكولات لتنفيذ هذا الفحص الأساسي5،6،10،11،12،13،14،15،<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر عددا لا يحصى من الطلاب في مختبراتنا (PJD و BJM) الذين عملوا معنا على مر السنين لتحسين هذه الأساليب. شكر خاص ل Stan Person ، الذي تم تطوير هذه المنهجية تحت وصايته لأول مرة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صندوق دعم البحوث الجامعية لكلية فيشر للعلوم والرياضيات بجامعة توسون وجسر NIGMS إلى منحة البكالوريا 5R25GM058264. هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. . Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).
- Mahy, B., Collier, L. . Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. . Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of ‘Right and Wrong Cases’ (Constant Stimuli) without Gauss’s formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
