Заторможенность вирусов простого герпеса

Summary

Plaquing – это обычный метод, используемый для количественной оценки живых вирусов в популяции. Хотя плакуирование часто преподается в различных учебных программах по микробиологии с бактериями и бактериофагами, плакуирование вирусов млекопитающих является более сложным и трудоемким. Этот протокол описывает процедуры, которые надежно функционируют для регулярной работы с вирусами простого герпеса.

Abstract

Существует множество опубликованных протоколов для успокаивания вирусов, включая ссылки в первичной литературе по методологии. Тем не менее, заражение вирусами может быть трудным для выполнения, требуя сосредоточения внимания на его спецификациях и уточнении. Это невероятно сложный метод для новых студентов, главным образом потому, что он требует тщательного внимания к самым мелким деталям. Эта демонстрация заторможенных вирусов простого герпеса должна помочь тем, кто на протяжении многих лет боролся с визуализацией метода, особенно его нюансов. Хотя эта рукопись основана на тех же принципах стандартной методологии упрочнения, она отличается тем, что содержит подробное описание (1) того, как лучше всего обрабатывать клетки-хозяева, чтобы избежать нарушения во время процесса, (2) более полезную вязкую среду, чем агароза, для ограничения диффузии вирионов и (3) простую процедуру фиксации и окрашивания, которая дает надежно воспроизводимые результаты. Кроме того, сопроводительное видео помогает продемонстрировать более тонкие различия в процессе, которые часто упускаются из виду при инструктаже других о проведении анализов бляшек.

Introduction

Начало анализов вирусных бляшек восходит к первым открытиям вирусов в 1890-х ^годах1. Вирус табачной мозаики сначала был выделен и передан на листьях табака, где отдельные пятна инфекции могли быть распознаны и количественно определены как происходящие от одного живого вирусного ^{образования2}, позже идентифицированного как вирион2. Более поздние семенные исследования с бактериями и бактериофагами усовершенствовали методы, используемые для бляшек этих вирусов, включая бактерии в середине фазы роста, последовательное разбавление образцов бактериофагов и верхний агар с последующей визуализацией буквальных отверстий (называемых бляшками) в бактериальном ^{газоне3}.

Размещение вирусов животных отставало от захватывающих исследований, проводимых с бактериофагами, главным образом потому, что методы, необходимые для выращивания клеток млекопитающих в культуре, не были разработаны до 1940-х годов. Однако появление растущих мышиных клеток в отсутствие всего организма-хозяина4 породило новую эру в способности культивировать и подсчитывать вирусы. Такая работа была расширена для распространения и количественного определения вируса энцефаломиелита западных лошадей в клетках кур и полиовируса в клетках ^{человека5,6}. По мере того, как область культивируемых клеток млекопитающих расширялась, множество различных клеток-хозяев для различных вирусных инфекций дало миру рог изобилия возможностей для изучения всевозможных ^{вирусов7}. Это включало распространение и количественную оценку вирусов герпеса человека, особенно вируса простого герпеса-1 (ВПГ-1) и -2 (ВПГ-2), которые вызывают поражения слизистой ^{оболочки8}. Важно отметить, что все анализы бляшек зависят от существования живых вирионов, которые могут проникать в клетки-хозяева рецепторно-опосредованным образом в ^{образце9}. Несмотря на повсеместное распространение и множество публикаций по выполнению анализов бляшек5,10,11,12,13,14,15,16, эти методы для ВПГ-1/-2 представляют собой смесь как искусства, так и науки; невозможно провести анализ без должного внимания к каждой детали протокола, равно как и нельзя выполнить успешный анализ без критического взгляда на тонкость в процессе. В этой рукописи изображен один из наиболее последовательно воспроизводимых методов анализа Бляшек ВПГ-1/-2 с точными деталями искусства анализа, которые редко обсуждаются.

Этот текущий протокол надежно получает количество живых бляшек (PFU) для ВПГ-1 и -2. Наилучшие результаты получены с использованием клеток Vero (трансформированных эпителиальных клеток почек африканской зеленой обезьяны) при низком пассаже (ниже числа пассажа 155) и обычно выращиваются в ^{альфа-MEM17} с добавлением 10% сыворотки плодного теленка (FCS), L-аланил-L-глутамина и смеси антибиотика / антимикотики18. Клетки Веро стандартно размножаются в этой среде два-три раза в неделю в ¹/₅ разведения каждый раз.

Protocol

Все процедуры с клетками Vero и живыми герпесвирусами были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Тоусона. Обобщенная схема этих процедур представлена на рисунке 1. 1. Посев клеток Vero За день до начала анализа б?…

Representative Results

В таблице 1 показан эксперимент, который имеет оптимальные результаты. Все 10-кратные разведения следуют за примерно 10-кратным уменьшением количества бляшек. Эти виды данных также можно увидеть на рисунке 2, фактическом анализе бляшек, где счетное количество бля…

Discussion

Хотя анализы бляшек почти так же стары, как и сама культура клеток млекопитающих, кажется, что каждая лаборатория имеет свой собственный набор протоколов для выполнения этого базового анализа5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<sup c…

Materials

12-well plates	Corning	3512
6-well plates	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Antibiotic/antimycotic	Gibco	15240096
Crystal violet	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++)	Gibco	14190144
Fetal calf serum	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hemacytometer	Thermo Fisher	02-671-54
Methylcellulose	Millipore-Sigma	27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Trypan Blue	Corning	25900CI
Trypsin	Cytiva	SH30042.01
Vero cells	ATCC	CCL-81