הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA
Summary
במאמר זה נתאר את השימוש בשיטת ההדמיה של מולקולה בודדת, DNA Curtains, כדי לחקור את המנגנון הביופיזי של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על דנ”א.
Abstract
גני האיחוי הנובעים מטרנסלוקציה כרומוזומלית נמצאו בגידולים מוצקים רבים או בלוקמיה. EWS-FLI1, השייך למשפחת אונקופרוטאינים מסוג FUS/EWS/TAF15 (FET), הוא אחד מגני האיחוי המעורבים ביותר בסרקומה ע”ש יואינג. חלבוני היתוך אלה ממשפחת FET מכילים בדרך כלל תחום בעל מורכבות נמוכה (LCD) של חלבון FET ב-N-terminus שלהם ותחום קושר דנ”א (DBD) ב-C-terminus שלהם. EWS-FLI1 אושר כיוצר עיבוי ביומולקולרי במוקדי הקישור שלו עקב אינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, ועיבויים אלה יכולים לגייס RNA פולימראז II כדי לשפר את שעתוק הגנים. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד מרכיבים עיבויים אלה באתרי הכריכה שלהם. לאחרונה, שיטת ביופיזיקה של מולקולה אחת – DNA Curtains – יושמה כדי לדמיין את תהליכי ההרכבה האלה של עיבוי EWS-FLI1. כאן נדון פרוטוקול הניסוי המפורט וגישות ניתוח הנתונים ליישום וילונות דנ”א בחקר המעבים הביומולקולריים המרכיבים על דנ”א המטרה.
Introduction
ויסות שעתוק הוא צעד מכריע לביטוי גנים מדויק בתאים חיים. גורמים רבים, כגון שינוי כרומוזומלי, גורמי שעתוק (TFs) ורנ”א שאינם מקודדים, משתתפים בתהליך מסובך זה 1,2,3. בין גורמים אלה, TFs תורמים לספציפיות של ויסות שעתוק על ידי זיהוי וקשירה לרצפי DNA ספציפיים המכונים מקדמים או משפרים ולאחר מכן גיוס חלבונים פונקציונליים אחרים להפעלה או לדיכוי שעתוק 4,5,6,7. האופן שבו ה-TFs האלה מצליחים לחפש את אתרי המטרה שלהם בגנום האנושי ולתקשר עם דנ”א המצופה בהיסטונים ובחלבונים קושרי דנ”א שאינם היסטון מבלבל מדענים כבר עשרות שנים. בשנים האחרונות נבנו מספר מודלים קלאסיים למנגנון חיפוש המטרה של TFs כדי לתאר כיצד הם “מחליקים”, “קופצים”, “קופצים” או “מעבירים אינטרסגמנטים” לאורך שרשרת הדנ”א 8,9,10,11. מודלים אלה מתמקדים בהתנהגות החיפוש בדנ”א של מולקולת TF אחת ויחידה. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי חלק מה-TFs עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) לבד בגרעין או עם קומפלקס מתווך12. הטיפות הנצפות של TFs קשורות לאזורי המקדם או המשפר, ומדגישות את התפקיד של היווצרות עיבוי ביומולקולרי בשעתוק ואת הגנום התלת-ממדי13,14,15. עיבויים ביומולקולריים אלה קשורים לתאים חסרי ממברנה in vivo ו– in vitro. הם נוצרים באמצעות LLPS, שבו ביו-מקרומולקולות מודולריות ואזורים בעלי הפרעה פנימית (IDR) של חלבונים הם שני הכוחות המניעים העיקריים של אינטראקציות רב-ערכיות16. לפיכך, TFs לא רק מחפשים דנ”א אלא גם מתפקדים בסינרגיה בתוך עיבוייםאלה 4,17,18. נכון להיום, התכונה הביופיזית של עיבוי שעתוק אלה על דנ”א עדיין אינה ברורה.
לכן, מחקר זה נועד ליישם שיטה של מולקולה בודדת – DNA Curtains – כדי לדמות ישירות את היווצרות ודינמיקה של עיבוי שעתוק שנוצר על ידי TFs על DNA במבחנה. DNA Curtains, פלטפורמת הדמיה במבחנה בתפוקה גבוהה לחקר האינטראקציה בין חלבונים לדנ”א, יושמה בתיקון דנ”א 19,20,21, חיפוש מטרה22, ו- LLPS 17,23,24. תא הזרימה של וילונות הדנ”א מצופה בדו-שכבתי שומנים ביוטיניליים כדי לעבור את פני השטח ולאפשר לביומולקולות להתפזר על פני השטח. תבניות הזיג-זג הננו-מיוצרות מגבילות את תנועת הדנ”א. מצעי דנ”א למבדה שעברו ביוטינילציה יכולים להתיישר לאורך קצוות המחסום ולהימתח על ידי זרימת החיץ המכוון. אותם רצפי התחלה וסיום של כל המולקולות מאפשרים מעקב אחר החלבון בדנ”א ומתארים את התפלגות המיקום של אירועי הקישור25,26. יתר על כן, השילוב של וילונות DNA עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) מסייע למזער את רעשי הרקע ולזהות אותות ברמה של מולקולה אחת. לפיכך, וילונות דנ”א יכולים להיות שיטה מבטיחה לחקור את הדינמיקה של היווצרות עיבוי שעתוק על מוטיבים של דנ”א. מאמר זה מתאר את הדוגמה של אונקופרוטאין ממשפחת FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, שנוצר על-ידי טרנסלוקציה כרומוזומלית. דנ”א למבדה המכיל 25× GGAA – רצף הקשירה של EWS-FLI127 – שימש כמצע הדנ”א בניסויי DNA Curtains כדי לבחון כיצד מולקולות EWS-FLI1 עוברות LLPS על דנ”א. כתב יד זה דן בפירוט בפרוטוקול הניסויי ובשיטות ניתוח הנתונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכיוון שגישות של מולקולה בודדת רגישות ביותר לתכולת מערכת התגובה, יש להשקיע מאמץ נוסף כדי להבטיח איכות טובה של כל החומרים והתמיסות במהלך ניסויי וילונות הדנ”א, במיוחד השומנים שהוכנו בסעיפים 1 ו-2 והמאגרים המשמשים בסעיף 5. יש להשתמש בריאגנטים בעלי טוהר גבוה יותר להכנת חוצצים, ומאגרים חייבים לה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NSFC מס ‘31670762 (Z.Q.).
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
- Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
- Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
- Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
- Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
- Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
- Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 생화학. 20 (24), 6929-6948 (1981).
- Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
- Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
- Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
- Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
- Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing’s sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
- Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
- Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).
- Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).
