DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi
Summary
Burada, DNA üzerinde birleşen EWS-FLI1 kondensatlarının biyofiziksel mekanizmasını incelemek için tek moleküllü görüntüleme yöntemi olan DNA Perdeleri’nin kullanımını açıklıyoruz.
Abstract
Kromozomal translokasyondan kaynaklanan füzyon genleri birçok solid tümörde veya lösemide bulunmuştur. Füzyon onkoproteinlerinin FUS/EWS/TAF15 (FET) ailesine ait olan EWS-FLI1, Ewing sarkomunda en sık tutulan füzyon genlerinden biridir. Bu FET ailesi füzyon proteinleri tipik olarak N-terminuslarında düşük karmaşıklıklı bir FET proteini alanı (LCD) ve C-terminuslarında bir DNA bağlayıcı alan (DBD) barındırır. EWS-FLI1’in LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle hedef bağlanma lokuslarında biyomoleküler kondensatlar oluşturduğu doğrulanmıştır ve bu yoğuşmalar gen transkripsiyonunu arttırmak için RNA polimeraz II’yi işe alabilir. Bununla birlikte, bu yoğuşmaların bağlanma bölgelerinde nasıl monte edildiği belirsizliğini korumaktadır. Son zamanlarda, EWS-FLI1 yoğuşmalarının bu montaj süreçlerini görselleştirmek için tek moleküllü bir biyofizik yöntemi olan DNA Perdeleri uygulandı. Burada, DNA Perdelerinin hedef DNA üzerine monte edilen biyomoleküler kondensatların incelenmesinde uygulanması için ayrıntılı deneysel protokol ve veri analizi yaklaşımları tartışılmaktadır.
Introduction
Transkripsiyonel düzenleme, canlı hücrelerde kesin gen ekspresyonu için çok önemli bir adımdır. Kromozomal modifikasyon, transkripsiyon faktörleri (TF’ler) ve kodlamayan RNA’lar gibi birçok faktör bu karmaşık sürece katılır 1,2,3. Bu faktörler arasında, TF’ler, promotörler veya arttırıcılar olarak bilinen spesifik DNA dizilerini tanıyarak ve bağlayarak ve daha sonra transkripsiyonuaktive etmek veya bastırmak için diğer fonksiyonel proteinleri işe alarak transkripsiyonel düzenlemenin özgüllüğüne katkıda bulunur 4,5,6,7. Bu TF’lerin insan genomundaki hedef bölgelerini aramayı ve histon olmayan DNA bağlayıcı proteinlerle kaplı DNA ile etkileşime girmeyi nasıl başardıkları, bilim adamlarını on yıllardır şaşırttı. Son birkaç yılda, TF’lerin hedef arama mekanizması için birkaç klasik model, DNA zinciri 8,9,10,11 boyunca nasıl “kaydıklarını”, “zıpladıklarını”, “zıpladıklarını” veya “bölümler arası transferi” tanımlamak için inşa edilmiştir. Bu modeller, tek bir TF molekülünün DNA’sı üzerindeki arama davranışına odaklanmıştır. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, bazı TF’lerin çekirdekte tek başına veya Mediator kompleksi12 ile sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) maruz kaldığını göstermektedir. TF’lerin gözlemlenen damlacıkları, promotör veya arttırıcı bölgelerle ilişkilidir ve biyomoleküler kondens oluşumunun transkripsiyondaki rolünü ve üç boyutlu genom 13,14,15’i vurgulamaktadır. Bu biyomoleküler kondensatlar, in vivo ve in vitro membran eksikliği olan bölmelerle bağlantılıdır. Modüler biyomakromoleküllerin ve proteinlerin içsel olarak düzensiz bölgelerinin (IDR’ler) çok değerli etkileşimlerin iki ana itici gücü olduğu LLPS aracılığıyla oluşturulurlar16. Böylece, TF’ler sadece DNA’yı aramakla kalmaz, aynı zamanda bu yoğuşmalar 4,17,18 içinde sinerjik olarak işlev görür. Bugüne kadar, bu transkripsiyon kondensatlarının DNA üzerindeki biyofiziksel özelliği belirsizliğini korumaktadır.
Bu nedenle, bu çalışma, TF’lerin DNA üzerinde oluşturduğu transkripsiyon kondensatlarının oluşumunu ve dinamiklerini in vitro olarak doğrudan görüntülemek için tek moleküllü bir yöntem olan DNA Perdeleri’ni uygulamayı amaçlamıştır. Proteinler ve DNA arasındaki etkileşimi incelemek için yüksek verimli bir in vitro görüntüleme platformu olan DNA Perdeleri, DNA onarımı19,20,21, hedef arama 22 ve LLPS 17,23,24’te uygulanmıştır. DNA Perdelerinin akış hücresi, yüzeyi pasifleştirmek ve biyomoleküllerin yüzeyde dağılmasına izin vermek için biyotinile lipit çift katmanları ile kaplanmıştır. Nanofabrikasyon zikzak desenleri DNA’nın hareketini sınırlar. Biyotinile Lambda DNA substratları bariyer kenarları boyunca hizalanabilir ve yönlendirilmiş tampon akışı tarafından gerilebilir. Tüm moleküllerin aynı başlangıç ve bitiş dizileri, proteinin DNA üzerinde izlenmesine izin verir ve bağlanma olaylarının konum dağılımını tanımlar25,26. Dahası, DNA Perdelerinin toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) ile kombinasyonu, arka plan gürültüsünü en aza indirmeye ve sinyalleri tek molekül düzeyinde algılamaya yardımcı olur. Bu nedenle, DNA Perdeleri, DNA motifleri üzerindeki transkripsiyon kondens oluşumunun dinamiklerini araştırmak için umut verici bir yöntem olabilir. Bu yazıda, kromozomal translokasyon tarafından üretilen bir FUS/EWS/TAF15 (FET) ailesi füzyon onkoproteini olan EWS-FLI1 örneği açıklanmaktadır. 25× GGAA içeren Lambda DNA’sı – EWS-FLI127’nin bağlanma dizisi – EWS-FLI1 moleküllerinin DNA üzerinde LLPS’ye nasıl maruz kaldığını gözlemlemek için DNA Perdeleri deneylerinde DNA substratı olarak kullanıldı. Bu yazıda deneysel protokol ve veri analiz yöntemleri ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek moleküllü yaklaşımlar reaksiyon sisteminin içeriğine karşı son derece hassas olduğundan, DNA Perdeleri deneyleri sırasında, özellikle bölüm 1 ve 2’de hazırlanan lipitler ve bölüm 5’te kullanılan tamponlar olmak üzere tüm malzemelerin ve çözeltilerin iyi kalitede olmasını sağlamak için ekstra çaba harcanmalıdır. Tamponları hazırlamak için daha yüksek saflıkta reaktifler kullanılmalı ve tamponlar tek moleküllü tahlil için taze hazırlanmalıdır.
500 nM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
- Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
- Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
- Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
- Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
- Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
- Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 생화학. 20 (24), 6929-6948 (1981).
- Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
- Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
- Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
- Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
- Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing’s sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
- Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
- Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).
- Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).
