Enkeltmolekylebilleddannelse af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA
Summary
Her beskriver vi brugen af enkeltmolekylebilleddannelsesmetoden, DNA Curtains, til at studere den biofysiske mekanisme af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA.
Abstract
Fusionsgenerne som følge af kromosomtranslokation er fundet i mange solide tumorer eller leukæmi. EWS-FLI1, som tilhører FUS/EWS/TAF15 (FET) familien af fusions-oncoproteiner, er et af de hyppigst involverede fusionsgener i Ewing-sarkom. Disse FET-familiefusionsproteiner har typisk et lavkompleksitetsdomæne (LCD) af FET-protein ved deres N-terminal og et DNA-bindende domæne (DBD) ved deres C-terminal. EWS-FLI1 er blevet bekræftet at danne biomolekylære kondensater på dets målbindende loci på grund af LCD-LCD- og LCD-DBD-interaktioner, og disse kondensater kan rekruttere RNA-polymerase II for at forbedre gentranskription. Hvordan disse kondensater samles på deres bindingssteder er dog stadig uklart. For nylig blev en enkeltmolekyle biofysikmetode – DNA Gardiner – anvendt til at visualisere disse samlingsprocesser af EWS-FLI1 kondensater. Her diskuteres de detaljerede eksperimentelle protokol- og dataanalysemetoder til anvendelse af DNA-gardiner til undersøgelse af de biomolekylære kondensater, der samles på mål-DNA.
Introduction
Transkriptionel regulering er et afgørende skridt for præcis genekspression i levende celler. Mange faktorer, såsom kromosomal modifikation, transkriptionsfaktorer (TF’er) og ikke-kodende RNA’er, deltager i denne komplicerede proces 1,2,3. Blandt disse faktorer bidrager TF’er til specificiteten af transkriptionel regulering ved at genkende og binde til specifikke DNA-sekvenser kendt som promotorer eller forstærkere og efterfølgende rekruttere andre funktionelle proteiner til at aktivere eller undertrykke transkription 4,5,6,7. Hvordan disse TF’er formår at søge efter deres målsteder i det menneskelige genom og interagere med DNA belagt med histoner og ikke-histon-DNA-bindende proteiner har forvirret forskere i årtier. I de sidste par år er flere klassiske modeller til målsøgningsmekanismen for TF’er blevet bygget til at beskrive, hvordan de “glider”, “hopper”, “hopper” eller “intersegmentoverførsel” langs DNA-kæden 8,9,10,11. Disse modeller er fokuseret på søgeadfærden på DNA’et fra et enkelt TF-molekyle. Nylige undersøgelser viser imidlertid, at nogle TF’er gennemgår væske-væskefaseseparation (LLPS) enten alene i kernen eller med Mediatorkomplekset12. De observerede dråber af TF’er er forbundet med promotor- eller forstærkerregionerne, hvilket fremhæver rollen som biomolekylær kondensatdannelse i transkription og det tredimensionelle genom13,14,15. Disse biomolekylære kondensater er forbundet med membran-manglende rum in vivo og in vitro. De dannes via LLPS, hvor modulære biomakromolekyler og iboende uordnede regioner (IDR’er) af proteiner er to hoveddrivkræfter for multivalente interaktioner16. Således søger TF’er ikke kun DNA, men fungerer også synergistisk inden for disse kondensater 4,17,18. Til dato forbliver den biofysiske egenskab af disse transkriptionskondensater på DNA uklar.
Derfor havde denne undersøgelse til formål at anvende en enkeltmolekylemetode – DNA-gardiner – til direkte at afbilde dannelsen og dynamikken af transkriptionskondensaterne dannet af TF’er på DNA in vitro. DNA Curtains, en high throughput in vitro imaging platform til at studere interaktionen mellem proteiner og DNA, er blevet anvendt i DNA-reparation 19,20,21, målsøgning22 og LLPS17,23,24. Flowcellen af DNA-gardiner er belagt med biotinylerede lipiddobbeltlag for at passivere overfladen og tillade biomolekylerne at diffundere på overfladen. De nanofabrikerede zig-zag-mønstre begrænser bevægelsen af DNA. Biotinylerede Lambda DNA-substrater kan justere langs barrierekanterne og strækkes af den orienterede bufferstrøm. De samme start- og slutsekvenser af alle molekylerne tillader sporing af proteinet på DNA og beskriver positionsfordelingen af bindingsbegivenhederne25,26. Desuden hjælper kombinationen af DNA-gardiner med total intern refleksionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) med at minimere baggrundsstøj og detektere signaler på et enkeltmolekyleniveau. DNA Gardiner kan således være en lovende metode til at undersøge dynamikken i transkriptionskondensatdannelse på DNA-motiver. Dette papir beskriver eksemplet på et FUS / EWS / TAF15 (FET) familie fusion oncoprotein, EWS-FLI1, genereret af kromosomal translokation. Lambda DNA indeholdende 25× GGAA – bindingssekvensen af EWS-FLI127– blev brugt som DNA-substrat i DNA Curtains-eksperimenterne til at observere, hvordan EWS-FLI1-molekyler gennemgår LLPS på DNA. Dette manuskript diskuterer den eksperimentelle protokol og dataanalysemetoder i detaljer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da enkeltmolekyletilgange er ekstremt følsomme over for indholdet af reaktionssystemet, skal der investeres ekstra indsats for at sikre god kvalitet af alle materialer og opløsninger under DNA-gardinerforsøgene, især lipiderne fremstillet i afsnit 1 og 2 og de buffere, der anvendes i afsnit 5. Reagenser af højere renhed skal anvendes til fremstilling af buffere, og buffere skal være frisklavede til enkeltmolekyleassay
Da 500 nM mCherry-mærket EWS-FLI1 blev skyllet ind i kammeret, dukked…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
- Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
- Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
- Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
- Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
- Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
- Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 생화학. 20 (24), 6929-6948 (1981).
- Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
- Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
- Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
- Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
- Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing’s sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
- Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
- Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).
- Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).
