Summary

培養骨細胞および単離骨軸におけるアミノ酸消費の評価

Published: April 13, 2022
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Summary

このプロトコルは、放射性標識アミノ酸取り込みアッセイを提示し、初代細胞または単離された骨のいずれかにおけるアミノ酸消費を評価するのに役立ちます。

Abstract

骨の発達と恒常性は、骨形成骨芽細胞の分化と活性に依存します。骨芽細胞の分化は、増殖とそれに続くタンパク質合成、そして最終的には骨基質分泌によって順次特徴付けられる。増殖およびタンパク質合成はアミノ酸の一定の供給を必要とする。それにもかかわらず、骨芽細胞におけるアミノ酸消費についてはほとんど知られていない。ここでは、放射性標識アミノ酸を使用してアミノ酸消費量を測定するように設計された非常に感度の高いプロトコルについて説明します。この方法は、骨芽細胞の増殖または分化、薬物または成長因子の治療、またはさまざまな遺伝子操作に関連するアミノ酸取り込みの変化を定量化するために最適化されています。重要なことに、この方法は、インビ トロ または単離された骨シャフトエクス ビボで培養細胞株または初代細胞におけるアミノ酸消費を定量化するために互換的に使用することができる。最後に、我々の方法は、グルコースおよび他の放射性標識栄養素と同様に、任意のアミノ酸の輸送を測定するために容易に適合させることができる。

Introduction

アミノ酸は、各アミノ酸に特異的な可変側鎖を有するアミノ(−NH2)およびカルボキシル(−COOH)官能基を含む有機化合物である。一般に、タンパク質の基本構成成分としてアミノ酸がよく知られている。最近では、アミノ酸の新たな用途や機能が解明されています。例えば、個々のアミノ酸を代謝して、生体エネルギーに寄与する中間代謝産物を生成し、酵素補因子として機能し、活性酸素種を調節し、または他のアミノ酸を合成するために使用される1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .多くの研究は、アミノ酸代謝が様々な状況における細胞の多能性、増殖、および分化に重要であることを示しています3611、1213、14151617

骨芽細胞は、コラーゲン1型に富む細胞外骨基質を産生および分泌する分泌細胞です。骨形成中に高いタンパク質合成速度を維持するために、骨芽細胞はアミノ酸の一定の供給を必要とします。この需要を満たすために、骨芽細胞は積極的にアミノ酸を獲得しなければなりません。これと一致して、最近の研究は、骨芽細胞活動および骨形成におけるアミノ酸の取り込みおよび代謝の重要性を明らかにしている15、16、17181920

骨芽細胞は、細胞外環境、細胞内タンパク質分解、de novoアミノ酸生合成の3つの主要なソースから細胞アミノ酸を獲得します。このプロトコルは、細胞外環境からのアミノ酸取り込みの評価に焦点を当てます。アミノ酸の取り込みを測定する最も一般的な方法は、放射性標識(例えば、3Hまたは14C)または重同位体標識(例えば、13C)アミノ酸のいずれかに依存する。重同位体アッセイは、アミノ酸の取り込みおよび代謝をより徹底的かつ安全に分析することができるが、サンプルの調製および誘導体化に1日かかり、サンプル数に応じて質量分析計で分析するのに数日かかるため、完了するまでに数日かかるため、より時間がかかる21,22。比較すると、放射性標識アミノ酸取り込みアッセイは、下流代謝について有益ではありませんが、安価で比較的迅速であり、実験の開始から2〜3時間以内に完了することができます23,24。ここでは、in vitroで培養された初代細胞または細胞株または個々の骨軸における放射性標識アミノ酸の取り込みを評価するために設計された、容易に変更可能な基本プロトコルについて説明します。これら2つのプロトコルの適用は、他の放射性標識アミノ酸および他の骨関連細胞型および組織に拡張することができる。

Protocol

本明細書に記載されているすべてのマウス手順は、ダラスのテキサス大学サウスウェスタン医療センターの動物研究委員会によって承認されました。放射線プロトコルは、ダラスのテキサス大学サウスウェスタン医療センターの放射線安全諮問委員会によって承認されました。 1. 細胞内におけるアミノ酸の取り込み(プロトコルI) プレート5 x 104</su…

Representative Results

アミノ酸輸送は、基質特異性、動態、イオンおよびpH依存性を含む多数の特性に基づいて異なる輸送システムに分類されている多くの膜結合アミノ酸トランスポーターによって調節されています25。例えば、グルタミンの取り込みは、Na+依存性輸送系A、ASC、γ+LおよびN、またはNa+非依存性系Lによって媒介され得る。Na+依存系は、Na+(系N)をLi+に…

Discussion

本明細書に記載されるプロトコルは、インビトロまたはエクスビボのいずれかの様々な実験的順列に応答してアミノ酸取り込みを評価するための迅速で高感度なアプローチを提供する。市販のキット(例えば、グルタミンおよびグルタミン酸測定キット)と比較すると、この方法は、はるかに感度が高く、迅速で、労働集約的ではない1617?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Karnerラボは、国立衛生研究所R01助成金(AR076325およびAR071967)によってC.M.K.にサポートされています。

Materials

0.25% trypsin Gibco 25200
12-well plate Corning 3513
1mL syringe BD precision 309628
30G Needle BD precision 305106
Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi PerkinElmer NET1123001MC
Beckman LS6500 scintillation counter
Calcium chloride Sigma C1016
choline chloride Sigma C7077
D-(+)-Glucose solution Sigma G8769
Dissection Tool Forceps, scissors, scapels
DPBS Gibco 14190
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma E9884
HEPES(1M) Gibco 15630
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine PerkinElmer NET551250UC
Liquid scintilation vials Sigma Z190535
lithium chloride solution, 8M Sigma L7026
Magnesium chloride Sigma M8266
MEMα Gibco 12561
Microcentrifuge tube, 15mL Biotix 89511-256
NP-40 Sigma 492016
Potassium chloride Sigma P3911
Sodium bicarbonate Sigma S6014
sodium chloride Sigma S9888
Sodium Deoxycholate Sigma D6750
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Sonicator Sonic&Materials VCX130
Tris Base Sigma 648311
Ultima Gold (Scintillation solution) PerkinElmer 6013329
α-(Methylamino)isobutyric acid Sigma M2383

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Cite This Article
Shen, L., Karner, C. M. Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts. J. Vis. Exp. (182), e62995, doi:10.3791/62995 (2022).

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