Évaluation de la consommation d’acides aminés dans les cellules osseuses en culture et les arbres osseux isolés
Summary
Ce protocole présente un test d’absorption d’acides aminés radiomarqués, utile pour évaluer la consommation d’acides aminés dans les cellules primaires ou dans les os isolés.
Abstract
Le développement osseux et l’homéostasie dépendent de la différenciation et de l’activité des ostéoblastes formant des os. La différenciation des ostéoblastes est caractérisée séquentiellement par une prolifération suivie d’une synthèse protéique et, finalement, d’une sécrétion de matrice osseuse. La prolifération et la synthèse des protéines nécessitent un apport constant en acides aminés. Malgré cela, on sait très peu de choses sur la consommation d’acides aminés dans les ostéoblastes. Nous décrivons ici un protocole très sensible conçu pour mesurer la consommation d’acides aminés à l’aide d’acides aminés radiomarqués. Cette méthode est optimisée pour quantifier les changements dans l’absorption des acides aminés qui sont associés à la prolifération ou à la différenciation des ostéoblastes, aux traitements médicamenteux ou aux facteurs de croissance, ou à diverses manipulations génétiques. Il est important de noter que cette méthode peut être utilisée de manière interchangeable pour quantifier la consommation d’acides aminés dans des lignées cellulaires cultivées ou des cellules primaires in vitro ou dans des puits osseux isolés ex vivo. Enfin, notre méthode peut être facilement adaptée pour mesurer le transport de l’un des acides aminés ainsi que du glucose et d’autres nutriments radiomarqués.
Introduction
Les acides aminés sont des composés organiques qui contiennent un groupe fonctionnel amino (-NH2) et carboxyle (-COOH) avec une chaîne latérale variable spécifique à chaque acide aminé. En général, les acides aminés sont bien connus comme le constituant de base des protéines. Plus récemment, de nouvelles utilisations et fonctions des acides aminés ont été élucidées. Par exemple, les acides aminés individuels peuvent être métabolisés pour générer des métabolites intermédiaires qui contribuent à la bioénergétique, fonctionnent comme cofacteurs enzymatiques, régulent les espèces réactives de l’oxygène ou sont utilisés pour synthétiser d’autres acides aminés 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études démontrent que le métabolisme des acides aminés est essentiel pour la pluripotence, la prolifération et la différenciation cellulaires dans divers contextes 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Les ostéoblastes sont des cellules sécrétoires qui produisent et sécrètent la matrice osseuse extracellulaire riche en collagène de type 1. Pour maintenir des taux élevés de synthèse des protéines pendant la formation osseuse, les ostéoblastes exigent un apport constant en acides aminés. Pour répondre à cette demande, les ostéoblastes doivent acquérir activement des acides aminés. Conformément à cela, des études récentes révèlent l’importance de l’absorption et du métabolisme des acides aminés dans l’activité des ostéoblastes et la formation osseuse 15,16,17,18,19,20.
Les ostéoblastes acquièrent des acides aminés cellulaires à partir de trois sources principales: le milieu extracellulaire, la dégradation des protéines intracellulaires et la biosynthèse de novo des acides aminés. Ce protocole se concentrera sur l’évaluation de l’absorption des acides aminés à partir de l’environnement extracellulaire. Les méthodes les plus courantes pour mesurer l’absorption des acides aminés reposent sur des acides aminés radiomarqués (p. ex., 3H ou 14C) ou des isotopes lourds marqués (p. ex. 13C). Les dosages d’isotopomères lourds peuvent analyser l’absorption et le métabolisme des acides aminés de manière plus approfondie et plus sûre, mais ils prennent plus de temps et prennent plusieurs jours à compléter car il faut une journée pour préparer et dérivatiser les échantillons et plusieurs jours pour analyser sur le spectromètre de masse en fonction du nombre d’échantillons21,22. En comparaison, les tests d’absorption des acides aminés radiomarqués ne sont pas informatifs sur le métabolisme en aval, mais sont peu coûteux et relativement rapides, pouvant être achevés dans les 2-3 heures suivant le début de l’expérience23,24. Ici, nous décrivons un protocole de base facilement modifiable conçu pour évaluer l’absorption d’acides aminés radiomarqués dans des cellules primaires en culture ou des lignées cellulaires in vitro ou des arbres osseux individuels ex vivo. L’application de ces deux protocoles peut être étendue à d’autres acides aminés radiomarqués et à d’autres types de cellules et de tissus associés aux os.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici fournit une approche rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés en réponse à diverses permutations expérimentales in vitro ou ex vivo. Par rapport aux kits disponibles dans le commerce (par exemple, les kits de détermination de la glutamine et du glutamate), cette méthode est beaucoup plus sensible, plus rapide et moins exigeante en main-d’œuvre16,17,25. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le laboratoire Karner est soutenu par des subventions R01 du National Institute of Health (AR076325 et AR071967) à C.M.K.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
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