배양된 뼈 세포와 분리된 뼈축의 아미노산 소비 평가
Summary
이 프로토콜은 방사성 표지 된 아미노산 섭취 분석을 제시하며, 이는 일차 세포 또는 분리 된 뼈에서 아미노산 소비를 평가하는 데 유용합니다.
Abstract
뼈 발달과 항상성은 골 형성 조골 세포의 분화와 활성에 달려 있습니다. 조골 세포 분화는 순차적으로 증식에 이어 단백질 합성과 궁극적으로 골 매트릭스 분비를 특징으로합니다. 증식과 단백질 합성에는 지속적인 아미노산 공급이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 조골 세포의 아미노산 소비에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 여기에서는 방사성 표지 된 아미노산을 사용하여 아미노산 소비를 측정하도록 설계된 매우 민감한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 조골 세포 증식 또는 분화, 약물 또는 성장 인자 치료 또는 다양한 유전자 조작과 관련된 아미노산 흡수의 변화를 정량화하는 데 최적화되어 있습니다. 중요하게도, 이 방법은 시험관 내 또는 생체 외 분리된 뼈 축에서 배양된 세포주 또는 일차 세포에서 아미노산 소비를 정량화하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 방법은 포도당 및 기타 방사성 표지 된 영양소뿐만 아니라 아미노산의 수송을 측정하기 위해 쉽게 적용 될 수 있습니다.
Introduction
아미노산은 각 아미노산에 특이적인 가변 측쇄를 가진 아미노(-NH2) 및 카르복실(-COOH) 작용기를 포함하는 유기 화합물입니다. 일반적으로 아미노산은 단백질의 기본 구성 성분으로 잘 알려져 있습니다. 보다 최근에는 아미노산의 새로운 용도와 기능이 해명되었습니다. 예를 들어, 개별 아미노산은 생체 에너지학에 기여하거나, 효소 보조 인자로서 기능하거나, 활성 산소 종을 조절하거나, 다른 아미노산 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10을 합성하는 데 사용되는 중간 대사 산물을 생성하기 위해 대사 될 수 있습니다. . 많은 연구에서 아미노산 대사가 다양한 맥락에서 세포 다 능성, 증식 및 분화에 중요하다는 것을 보여줍니다 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
조골세포는 콜라겐 유형 1이 풍부한 세포외 뼈 기질을 생성하고 분비하는 분비 세포입니다. 뼈가 형성되는 동안 높은 단백질 합성 속도를 유지하기 위해 조골 세포는 아미노산의 지속적인 공급을 요구합니다. 이러한 요구를 충족시키기 위해 조골 세포는 적극적으로 아미노산을 획득해야합니다. 이와 일치하여 최근 연구는 조골 세포 활동 및 골 형성 15,16,17,18,19,20에서 아미노산 흡수 및 대사의 중요성을 보여줍니다.
조골 세포는 세 가지 주요 공급원으로부터 세포 아미노산을 얻습니다 : 세포 외 환경, 세포 내 단백질 분해 및 de novo 아미노산 생합성. 이 프로토콜은 세포 외 환경으로부터의 아미노산 흡수 평가에 초점을 맞출 것이다. 아미노산 흡수를 측정하는 가장 일반적인 방법은 방사성 표지 (예 : 3H또는 14C) 또는 중위 동위 원소 표지 (예 : 13C) 아미노산에 의존합니다. 중위원소 분석은 아미노산 흡수 및 대사를 보다 철저하고 안전하게 분석할 수 있지만 샘플을 준비하고 유도체화하는 데 하루가 걸리고 샘플 수에 따라 질량분석기에서 분석하는 데 며칠이 걸리기 때문에 완료하는 데 며칠이 걸리기 때문에 완료하는 데 더 많은 시간이 소요됩니다(21,22). 이에 비해 방사성 표지 된 아미노산 섭취 분석은 하류 대사에 대한 정보가 아니지만 저렴하고 비교적 빠르며 실험시작 23,24에서 2-3 시간 내에 완료 될 수 있습니다. 여기에서는 생체 외 배양 된 1 차 세포 또는 세포주 또는 개별 뼈 샤프트에서 방사성 표지 된 아미노산 흡수를 평가하도록 설계된 쉽게 수정할 수있는 기본 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 두 프로토콜의 적용은 다른 방사성 표지된 아미노산 및 다른 뼈 관련 세포 유형 및 조직으로 확장될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 시험관내 또는 생체외 중 다양한 실험 순열에 반응하여 아미노산 흡수를 평가하기 위한 빠르고 민감한 접근법을 제공한다. 시판되는 키트(예를 들어, 글루타민 및 글루타메이트 측정 키트)와 비교할 때, 이 방법은 훨씬 더 민감하고, 더 빠르며, 덜 노동 집약적이다16,17,25. 우리의 프로토?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Karner 연구소는 국립 보건원 R01 보조금 (AR076325 및 AR071967)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
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