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Genetics

Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/63008
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

Summary

Cet article détaille un protocole d’identification rapide des indels induits par CRISPR/Cas9 et la sélection de lignées mutantes chez le moustique Aedes aegypti à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution.

Abstract

L’édition de gènes de moustiques est devenue une routine dans plusieurs laboratoires avec la mise en place de systèmes tels que les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN), les nucléases à doigts de zinc (ZFN) et les endonucléases de homing (HE). Plus récemment, la technologie CRISPR (CRISPR) / protéine 9 associée à CRISPR (CAS9) a offert une alternative plus facile et moins chère pour l’ingénierie du génome de précision. Après l’action de la nucléase, les voies de réparation de l’ADN répareront les extrémités brisées de l’ADN, introduisant souvent des indels. Ces mutations hors cadre sont ensuite utilisées pour comprendre la fonction des gènes dans les organismes cibles. Un inconvénient, cependant, est que les individus mutants ne portent aucun marqueur dominant, ce qui rend l’identification et le suivi des allèles mutants difficiles, en particulier aux échelles nécessaires pour de nombreuses expériences.

L’analyse de fusion à haute résolution (HRMA) est une méthode simple pour identifier les variations dans les séquences d’acides nucléiques et utilise des courbes de fusion PCR pour détecter de telles variations. Cette méthode d’analyse post-PCR utilise des colorants fluorescents à double brin liant l’ADN avec une instrumentation dotée d’une capacité de capture de données de contrôle de la température et facilement mise à l’échelle à des formats de plaques à 96 puits. Décrit ici est un flux de travail simple utilisant HRMA pour la détection rapide des indels induits par CRISPR / Cas9 et l’établissement de lignées mutantes chez le moustique Ae. aegypti. De manière critique, toutes les étapes peuvent être effectuées avec une petite quantité de tissu de jambe et ne nécessitent pas de sacrifier l’organisme, ce qui permet d’effectuer des croisements génétiques ou des tests de phénotypage après le génotypage.

Introduction

En tant que vecteurs d’agents pathogènes tels que les virus de la dengue1, zika2 et chikungunya3, ainsi que des parasites du paludisme4, les moustiques représentent une menace importante pour la santé publique humaine. Pour toutes ces maladies, l’intervention de transmission est fortement axée sur la lutte contre les moustiques vecteurs. L’étude des gènes importants, par exemple, dans la permissivité des agents pathogènes, la condition physique des moustiques, la survie, la reproduction et la résistance aux insecticides est essentielle pour développer de nouvelles stratégies de lutte contre les moustiques. À ces fins, l’édition du génome chez les moustiques devient une pratique courante, en particulier avec le développement de technologies telles que les HE, les ZFN, les TALEN et, plus récemment, CRISPR avec Cas9. L’établissement de souches génétiquement modifiées implique généralement le croisement d’individus porteurs des mutations souhaitées pendant quelques générations afin de minimiser les effets hors cible et fondateurs (goulot d’étranglement), suivis du croisement d’individus hétérozygotes pour générer des lignées homozygotes ou trans-hétérozygotes. En l’absence d’un marqueur dominant, le génotypage moléculaire est nécessaire dans ce processus car, dans de nombreux cas, aucun trait phénotypique clair ne peut être détecté pour les mutants hétérozygotes.

Bien que le séquençage soit l’étalon-or pour la caractérisation génotypique, le faire sur des centaines, voire des milliers d’individus, entraîne des coûts, de la main-d’œuvre et du temps importants pour obtenir des résultats, ce qui est particulièrement critique pour les organismes à courte durée de vie tels que les moustiques. Les solutions de rechange couramment utilisées sont le test de nucléase Surveyor5 (SNA), le test T7E16 et l’analyse de fusion à haute résolution (HRMA, examiné dans 7). SNA et T7E1 utilisent tous deux des endonucléases qui ne coupent que des bases incompatibles. Lorsqu’une région mutée du génome mutant hétérozygote est amplifiée, des fragments d’ADN provenant d’allèles mutants et de type sauvage sont recuits pour former de l’ADN double brin dépareillé (ADNds). Le SNA détecte la présence d’inadéquations par digestion avec une endonucléase spécifique à l’inadéquation et une électrophorèse simple sur gel d’agarose. Alternativement, HRMA utilise les propriétés thermodynamiques de l’ADNds détectés par les colorants fluorescents liant l’ADNds, la température de dissociation du colorant variant en fonction de la présence et du type de mutation. HRMA a été utilisé pour la détection de polymorphismes mononucléotidiques (SNP)8, le génotypage mutant du poisson zèbre9, les applications microbiologiques10 et la recherche en génétique végétale11, entre autres.

Cet article décrit HRMA, une méthode simple de génotypage moléculaire pour les moustiques mutants générée par la technologie CRISPR/Cas9. Les avantages de HRMA par rapport aux techniques alternatives comprennent 1) la flexibilité, car elle s’est avérée utile pour divers gènes, une large gamme de tailles d’indel, ainsi que la distinction entre différentes tailles d’indel et la différenciation hétérozygote, homozygote et trans-hétérozygote12,13,14, 2) le coût, car il est basé sur les réactifs PCR couramment utilisés, et 3) le gain de temps, car il peut être effectué en quelques heures seulement. En outre, le protocole utilise une petite partie du corps (une jambe) comme source d’ADN, permettant au moustique de survivre au processus de génotypage, permettant l’établissement et le maintien de lignées mutantes.

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Protocol

1. Recherche de polymorphismes mononucléotidiques (SNP), conception de l’amorce HRMA et validation de l’amorce

  1. Identification SNP chez les moustiques de colonie de laboratoire de type sauvage
    1. Sélectionnez l’exon cible pour perturber la traduction appropriée des polypeptides.
      REMARQUE: La cible doit être proche du codon de départ ou parmi les résidus clés nécessaires à la fonction protéique. Plus l’exon est court (par exemple, ≤200 bases), plus il est difficile à cibler et à analyser. Évitez d’éditer près des limites d’un exon, car cela force l’un des amorces HRMA à traverser un intron ou à être dans un intron. Cela n’est pas souhaitable car les taux de SNP ont tendance à être beaucoup plus élevés dans ces régions.
    2. Conception de l’apprêt
      1. Rendez-vous sur le site Web NCBI Blast - Primer Blast15, copiez et collez l’exon choisi dans la boîte en haut de la page | choisissez la taille du produit PCR (assurez-vous qu’il englobe la majeure partie de l’exon) | choisissez l’organisme.
      2. Cliquez sur Paramètres avancés | Optez (pour PCR Product Tm) et ajoutez 60 (pour une température optimale de 60 °C) | Obtenez des amorces. Conservez les autres paramètres par défaut.
    3. Obtenir de l’ADN génomique (ADNg) de la colonie de laboratoire de type sauvage. Réservez 10 moustiques, anesthésiez-les avec du CO2 et placez-les dans une boîte de Pétri sur de la glace pour les garder inactifs. Installez 10 tubes contenant 0,5 μL de réactif pour la libération d’ADN des tissus et 20 μL de tampon de dilution, tous deux fournis dans le kit de libération d’ADN suggéré dans la table des matériaux.
    4. Retirez une jambe d’un seul moustique à l’aide d’une pince et placez-la dans un tube correspondant d’une solution diluée du réactif de libération d’ADN (à partir de l’étape 1.1.3), en immergeant complètement la jambe dans la solution. Répétez cette étape avec les moustiques restants, en essuyant les pinces avec 70% d’éthanol avant de passer à la suivante.
    5. Incuber la solution contenant la jambe à température ambiante pendant 2 à 5 min, puis à 98 °C pendant 2 min, et laisser refroidir tout en mettant en place la réaction PCR.
      REMARQUE: Les plaques contenant l’ADNg libéré peuvent être stockées à -20 ° C et le protocole peut être mis en pause à ce stade.
    6. Préparer 10 tubes contenant 10 μL de 2x PCR Master Mix, des amorces à une concentration finale de 0,5 μM et de l’eau de qualité moléculaire à un volume final de 20 μL, et transférer 1 μL de l’échantillon dilué dans chaque tube. Effectuer la PCR en suivant ces paramètres de cycle : 98 °C 5 min, 40 cycles de 98 °C pendant 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s par ko ; extension finale de 72 °C pendant 1 min.
    7. Purifier les produits pcR avec une enzyme pour dégrader les amorces de PCR résiduelles et déphosphoryler l’excès de dNTP ou tout kit de nettoyage de colonne. Procédez au séquençage des échantillons.
    8. Analysez chaque électrophérogramme pour détecter la présence de doubles pics/bases ambiguës et ajustez manuellement les appels de base dans chaque séquence à l’aide du code de base dégénéré approprié.
      REMARQUE: Cette étape doit être effectuée avant l’alignement de plusieurs séquences, car il est courant que le logiciel appelant la base sélectionne le pic le plus important comme « vrai » appel de base, donnant la fausse impression d’une absence de SNP.
    9. Effectuez un alignement de plusieurs séquences à l’aide du logiciel d’alignement SeqMan Pro répertorié dans la table des matériaux ou d’un autre logiciel d’alignement open source, tel que ClustalW16 ou T-Coffee17.
      1. Ouvrez le logiciel d’alignement | cliquez sur Ajouter des séquences | sélectionnez les séquences souhaitées et cliquez sur Ajouter | une fois toutes les séquences choisies, cliquez sur Terminé.
      2. Cliquez sur Assembler pour effectuer l’alignement. Pour ouvrir l’alignement, cliquez sur Contig 1 et analysez l’alignement et identifiez les SNP (Figure 1).
        REMARQUE : Comme solution de rechange aux étapes 1.1.3 à 1.1.6, la PCR peut être effectuée à partir d’ADN génomique isolé obtenu à partir d’échantillons en vrac (provenant d’individus >10). Les amplicons séquencés peuvent être analysés directement pour détecter la présence de SNP apparaissant sous forme de doubles pics dans l’électrophérogramme, bien que les SNP rares soient plus difficiles à détecter.
    10. Concevoir 3 à 5 ARN à guide unique (SGRNV), en évitant les régions contenant tout SNP identifié ci-dessus, en suivant le protocole décrit en 18.
  2. Conception de l’apprêt HRMA
    1. Testez la séquence d’exons pour la formation possible de structures secondaires pendant la PCR à l’aide de mFold19.
      1. Accédez au serveur Web UNAFold | cliquez sur mFold | dans le menu déroulant, cliquez sur Applications | Forme de repliement de l’ADN.
      2. Entrez le nom de la séquence dans la zone et collez l’exon.
      3. Modifier la température de pliage à 60 °C; sur les conditions ioniques, changer [Mg++] à 1,5 et sur les unités passer à mM; cliquez sur Fold DNA.
      4. Sur Sortie, sous Structure 1, cliquez sur pdf pour ouvrir les tracés de structure circulaire.
    2. Accédez à NCBI Blast - Primer Blast15 pour la conception de l’apprêt.
    3. Copiez et collez la séquence d’exons sélectionnée déterminée par séquençage à l’étape 1.1 (la séquence qui contient le plus petit nombre de SNP ou aucun SNP) dans la zone en haut de la page.
    4. Utilisez le symbole < > pour marquer et exclure les séquences qui contiennent des SNP, le site cible et les régions avec la formation possible d’une structure secondaire.
    5. Sélectionnez la taille du produit PCR entre 80 et 150 pb et choisissez l’organisme.
      REMARQUE: Des tailles de fragments plus grandes peuvent être utilisées avec succès (~ 300 bp). Cependant, des amplicons plus longs peuvent diminuer la sensibilité entre des séquences différant en une ou quelques paires de bases.
    6. Cliquez sur Obtenir des amorces. Sélectionnez 2 à 3 paires d’amorces à tester (idéalement, les sites d’amorce sont à ≥20 à 50 pb de tout site cible CRISPR).
  3. Validation de l’amorce
    1. Effectuez une PCR à gradient à l’aide de l’ADNg d’une seule personne.
      1. Préparez un mélange maître et retirez un échantillon pour le contrôle sans gabarit (NTC) dans un tube séparé. Ajoutez le gabarit au mélange principal restant et aliquote dans une plaque de 96 puits.
      2. Suivez les paramètres de cyclisme : 98 °C 30 s, 34 cycles de 98 °C pendant 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s ; prolongation finale de 72 °C pendant 10 min.
      3. Générez des profils de fusion thermique en suivant les paramètres : étape de dénaturation 95 °C pendant 1 min, recuit 60 °C pendant 1 min, détection de la courbe de fusion entre 75 °C et 95 °C par incréments de 0,2 °C, avec un temps de maintien de 10 s à chaque température.
        REMARQUE: Seules les températures de recuit avec un seul profil de fusion thermique doivent être utilisées.
  4. Procéder à la génération des lignées mutantes avec des injections d’embryons comme décrit en 12.

2. Préparation de l’ADN génomique des pattes de moustiques

  1. Séparez les moustiques G1 par sexe au stade nymphal afin qu’ils ne s’accouplent pas avant le génotypage, et assurez-vous que des moustiques témoins de type sauvage et appariés selon l’âge seront disponibles pour être utilisés pour les références et les rétrocroisements. Séparez-les de sexe de même.
  2. Rassembler les matériaux nécessaires (figure 2A) et préparer une plaque de PCR de 96 puits avec 0,5 μL du réactif de libération d’ADN et 20 μL de tampon de dilution (du kit de libération d’ADNg) par individu à génotyper (figure 2B) et laisser sur la glace. Réservez deux réactions pour NTC.
  3. Étiquetez un plateau pour les flacons de moustiques (flacons de drosophiles ) afin que chaque puits sur la plaque de 96 corresponde au flacon de moustique respectif dans le plateau.
  4. Anesthésiez les moustiques G1 avec du CO2 et placez-les dans une boîte de Petri en verre pour les garder sous sédation (Figure 2C,D). Anesthésiez et placez 8 moustiques de type sauvage dans une deuxième boîte de Pétri.
  5. Essuyez une pince à épiler avec de l’éthanol à 70 % et retirez l’une des pattes postérieures des moustiques (Figure 2E, F).
  6. Immergez la jambe dans la solution de réactif à libération d’ADN, placez le moustique dans le flacon correspondant et fermez-le avec une éponge (Figure 2G,H).
  7. Essuyez à nouveau la pince à épiler avec de l’éthanol à 70% et retirez la jambe du moustique suivant. Répétez les étapes 2.5 à 2.7 jusqu’à ce que la plaque de 96 puits soit terminée.
    REMARQUE: Il est important d’essuyer la pince à épiler avec de l’éthanol à 70%. Cela minimise la contamination croisée de l’ADN.
  8. Sceller la plaque à l’aide d’un joint optique à plaque PCR (Figure 2I) et incuber la plaque de 96 puits contenant les pieds à température ambiante (RT) pendant 2 à 5 min, puis à 98 °C pendant 2 min. Laissez la plaque refroidir à RT pendant la préparation du mélange PCR.
    REMARQUE: L’ensemble du processus prend généralement 3-4 h. Si les moustiques doivent être conservés dans les flacons pendant plus de temps que la durée prévue (en particulier ≥1 jour), placez un petit morceau de raisin sec (ou source de sucre et d’eau) avec chaque moustique pour assurer la survie des moustiques pendant les incubations prolongées.

3. HRMA

  1. Effectuez la PCR.
    1. Préparer un mélange maître contenant les composants suivants pour chaque réaction : 10 μL de tampon 2x (du kit de libération d’ADNg), 0,5 μM de chaque apprêt, 1 μL de colorant EvaGreen, 0,4 μL de polymérase (du kit de libération d’ADNg), et compléter à 19 μL avec de l’eau de qualité moléculaire.
    2. À l’aide d’une pipette multicanal, transférez 19 μL du mélange maître dans chaque puits. Transférer 1 μL de la solution de libération d’ADN contenant de l’ADN de moustique préparée à la section 2 sur la plaque (Figure 3A). Scellez la plaque avec un joint optique de plaque PCR.
    3. Effectuer la PCR en suivant les paramètres de cycle : 98 °C pendant 5 min, 39 cycles de 98 °C pendant 10 s, la température de recuit choisie (72 °C) pendant 30 s ; extension finale 72 °C pendant 2 min.
  2. Générez des profils de fusion thermique en suivant les paramètres : étape de dénaturation 95 °C pendant 1 min, recuit 60 °C pendant 1 min, détection de la courbe de fusion entre 75 °C et 95 °C par incréments de 0,2 °C, avec un temps de maintien de 10 s à chaque température. Reportez-vous au matériel supplémentaire et à la figure supplémentaire S1-S5 pour obtenir une description détaillée de la configuration logicielle pour l’exécution de HRMA à l’aide du système en temps réel CFX96.
  3. Examinez les profils de fusion (Figure 3B). Affectez un contrôle de type wild au cluster de référence.
    REMARQUE: Le logiciel (voir la table des matériaux) normalise automatiquement les données et désigne des clusters avec des couleurs pour différentes courbes de fusion.
  4. Marquez les différents clusters avec les couleurs correspondantes sur le modèle de 96 puits (Figure 3C).
  5. Sélectionnez les individus avec des courbes d’intérêt, retirez-les des tubes et rétrocroisez -- (Figure 3D). Nourrissez les femelles accouplées et recueillez des œufs de G2 .

4. Vérification des séquences par séquençage sanger

  1. Purifier le produit pcR des puits avec des moustiques sélectionnés (à partir de la plaque préparée à la section 3.1), en utilisant une enzyme pour dégrader les amorces de PCR résiduelles et déphosphoryler l’excès de dNTP. Vous pouvez également utiliser n’importe quel kit de nettoyage de colonne et procéder au séquençage des échantillons.
    REMARQUE: Le séquençage direct peut être plus difficile lorsque la taille du produit PCR est petite (≤200 pb). Dans de tels cas, concevez des amorces pour amplifier des fragments plus grands englobant le site cible (≥250 pb) et amplifier par PCR en utilisant l’ADN dans la plaque de 96 puits (étape 2.2).
  2. Analysez et identifiez les indels à l’aide d’un logiciel de visionneuse de traces (Figure 4). Alternativement, Poly Peak Parser software20 peut aider à détecter la mutation chez les individus hétérozygotes.
    1. Accédez au site Web Poly Peak Parser, sélectionnez la séquence parmi les individus mutants dans le menu Parcourir , puis copiez et collez la séquence de référence dans la zone.
      REMARQUE: L’alignement entre l’allèle alternatif et la référence apparaîtra automatiquement sur le côté droit de l’écran.

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Representative Results

Les moustiques contenant des mutations dans les gènes AaeZIP11 (transporteur putatif de fer21) et myo-fem (un gène de myosine à biais féminin lié aux muscles volants13) ont été obtenus à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9, génotypés à l’aide de HRMA et vérifiés par séquence (Figure 5). La figure 5A et la figure 5C montrent l’intensité de fluorescence normalisée des courbes HRM des échantillons mutants AaeZIP11 et myo-fem, respectivement, ainsi que des témoins de type sauvage. La figure 4B et la figure 4D montrent le grossissement des courbes de différence (à partir des échantillons mutants AaeZIP11 et myo-fem, respectivement) entre les profils de fusion des différents amas attribués par le logiciel après soustraction de chaque courbe de la référence de type sauvage. Les individus mutants hétérozygotes et homozygotes AaeZIP11 ont été placés dans différents groupes et se distinguent facilement des témoins de type sauvage (figure 5B). Les individus myo-fem mutants hétérozygotes sont également distincts des témoins (Figure 5D). Il convient de noter que deux grappes au sein des témoins de type sauvage étaient présentes dans les deux cas, probablement en raison de la présence de SNP dans la région cible (figure 5), ce qui souligne la nécessité d’utiliser plusieurs échantillons de contrôle pour éviter de catégoriser les témoins comme des mutants lorsque les SNP ne peuvent être évités.

La figure 4A montre l’analyse de séquence du mutant AaeZIP11 . L’électrophérogramme des mutants hétérozygotes AaeZIP11 indique la position nucléotidique où l’indel s’est produit. Ceci est représenté par un passage des pics simples aux pics doubles, car les positions polymorphes montreront les deux nucléotides de manière concomitante (figure 4A). Le nombre de paires de bases supprimées ou insérées a été calculé en comptant les pics uniques à la fin de la course (Figure 4B) car l’un des brins d’ADN sera plus court ou plus long que l’autre par le nombre de paires de bases supprimées ou insérées, respectivement. Il est recommandé d’utiliser l’ADNg vérifié par séquence des mutants comme référence pour l’identification des hétérozygotes afin de faciliter les analyses HRMA pour les générations suivantes. L’affectation manuelle des courbes peut être nécessaire lorsque des courbes similaires sont automatiquement affectées à différents clusters. Cela peut être fait en comparant les courbes décalées par la température et les courbes de différence. Un ajustement manuel du logiciel peut être nécessaire pour affecter correctement les échantillons aux clusters. Les résultats HRMA d’AaeZIP11 et d’un mutant appelé Aeflightin montrent que des analyses d’échantillons individuels étaient nécessaires pour catégoriser avec succès les hétérozygotes, les homozygotes et les trans-hétérozygotes. Initialement, l’affectation automatique du cluster à partir du logiciel ne pouvait pas faire une distinction correcte entre les groupes (Figure 6A, Figure 6C, Figure 6E et Figure 6G). Chaque échantillon a ensuite été analysé individuellement et assigné aux groupes appropriés en fonction de la similitude avec les échantillons de référence d’hétérozygotes, d’homozygotes et de trans-hétérozygotes (préalablement vérifiés par séquençage) (Figure 6B, Figure 6D, Figure 6F et Figure 6H).

Figure 1
Figure 1 : Identification SNP. Représentation schématique de l’alignement de séquences multiples du fragment AaeZIP11 de type sauvage. En rouge sont les SNP, et en vert sont les fragments exempts de SNP; cette région sans SNP est suggérée pour la conception de l’ARNg et de l’amorce. Abréviations : SNP = polymorphisme mononucléotidique ; SGRNA = ARN guide unique; LVP = souche Liverpool. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Procédure expérimentale pour obtenir de l’ADN génomique à partir de pattes de moustiques pour HRMA. (A) Matériaux pour l’obtention d’ADN génomique, y compris les pipettes, les pointes, la plaque PCR, le joint optique, le réservoir, le tampon de dilution et la solution de libération d’ADN. B) Préparation de plaques PCR contenant un réactif de libération d’ADN et un tampon de dilution. (C) Anesthésie anti-moustiques au CO2. (D) Essuyer la pince à épiler avec de l’éthanol à 70 % pour éviter toute contamination entre les échantillons. (E) Installation expérimentale comprenant une pince à épiler, une grille pour flacons de moustiques, une boîte de Petri sur le dessus d’un récipient de glace avec des moustiques anesthésiés et la plaque PCR préalablement préparée. (F) Retrait de la patte de moustique. (G) Vue zoom de la patte de moustique immergée dans la solution de réactif de libération d’ADN. (H) Moustique unique placé dans le flacon. (I) Scellement de la plaque PCR contenant les pattes de moustique. Abréviation : HRMA = analyse de fusion à haute résolution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Procédure expérimentale pour les analyses de GRH. (A) Transfert de l’ADNg libéré sur une plaque de 96 puits contenant le mélange PCR. (B) Inspection visuelle des courbes de différence. (C) Marquer chaque échantillon sur le gabarit de 96 puits avec la même couleur que sa couleur de courbe de différence respective. (D) Rétrocroisement des individus d’un même groupe. Abréviations : HRM = fusion haute résolution ; ADNg = ADN génomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse séquentielle d’un mutant AaeZIP11. (A) Alignement nucléotidique du mutant AaeZIP11Δ56. Les tirets surlignés en jaune sont les bases supprimées. Dans la boîte, l’électrophérogramme passe de pics simples à pics doubles, illustrant la position où la suppression s’est produite (flèche). (B) Électrophérogramme de la fin de la séquence de séquençage et du passage des pics doubles aux pics simples. Notez que le nombre de pics simples représente le nombre de bases supprimées (rectangle gris). Les séquences d’amorces sont fournies dans le tableau supplémentaire S1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : HRMA de l’ADN extrait des pattes de moustiques. L’ADN a été extrait d’une seule jambe des moustiques AaeZIP11 (A et B) et myo-fem (C et D) knockout Ae. aegypti et analysé par HRMA. A et C désignent les signaux de fluorescence normalisés des échantillons à des valeurs relatives de 1,0 à 0. B et D désignent le grossissement des différences de courbe en soustrayant chaque courbe de la référence de type sauvage (déformation de Liverpool). Abréviations : HRMA = analyse de fusion à haute résolution; LVP = souche liverpool; RFU = unités de fluorescence relatives. Les séquences d’amorces sont fournies dans le tableau supplémentaire S1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Exemples d’affectations manuelles de groupes. (A-D) HRMA pour les mutants Aeflightin. (A et C) Les courbes de fusion (courbes d’échelle linéaire normalisées et courbes de différence, respectivement) sont automatiquement regroupées par le logiciel d’analyse de fusion de précision. (B) Normalisation des courbes différentielles modifiées manuellement. (D) Après modification de la normalisation des courbes différentielles, chaque échantillon a été attribué individuellement par les températures maximales dans les courbes de différence pour les témoins positifs correspondants (échantillons précédemment séquencés identifiés par les hétérozygotes Δ4 et Δ5 et les trans-hétérozygotes Δ4Δ5), permettant l’identification claire des 3 groupes. Des flèches rouges et brunes sont ajoutées pour mettre en évidence les pics à différentes températures. (E-H) HRMA pour les mutants AaeZIP11. (E et G) Les courbes de fusion sont automatiquement attribuées par le logiciel. (F et H) Les mutants dans le deuxième auto-croisement hétérozygote ont été attribués de manière appropriée aux groupes corrects par la similitude des courbes normalisées et de différence avec les références précédemment déterminées (codées par couleur dans les courbes). Heterozygotes asg, Homozygotes asg et Trans-heterozygotes asg : courbes de fusion assignées par Precision Melt Analysis Software. Abréviations : HRMA = analyse de fusion à haute résolution; LVP = souche liverpool; RFU = unités de fluorescence relatives. Les séquences d’amorces sont fournies dans le tableau supplémentaire S1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Matériel supplémentaire: Protocole détaillé pour la configuration de HRMA dans le système en temps réel CFX96 (par exemple, Bio-rad). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S1 : Instructions étape par étape pour la configuration du protocole de cycle sur Bio-rad CFX Manager. Voir les documents supplémentaires 2.1 à 2.3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Instructions étape par étape pour une configuration de plaque sur Bio-rad CFX Manager. Voir les documents supplémentaires 3.1 à 3.4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Instructions étape par étape pour la configuration d’une plaque sur Bio-rad CFX Manager. Voir les documents supplémentaires 3.5 à 3.6. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Instructions pas à pas pour la configuration de l’exécution sur Bio-rad CFX Manager. Voir le document supplémentaire 4.1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S5 : Instructions étape par étape pour l’analyse HRMA sur Bio-rad CFX Manager. Voir les documents supplémentaires 5.1 à 5.3. Abréviation : HRMA = analyse de fusion à haute résolution. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Liste des amorces. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

L’analyse de fusion à haute résolution offre une solution simple et rapide pour l’identification des indels générés par la technologie CRISPR/Cas9 chez le moustique vecteur Ae. aegypti. Il offre de la flexibilité, permettant le génotypage des moustiques mutés pour un large éventail de gènes allant du muscle de vol au métabolisme du fer et plus encore13,14. HRMA peut être effectué en quelques heures seulement, de la collecte de l’échantillon aux analyses finales. Un temps supplémentaire est nécessaire pour la conception de l’amorce et dépendra également du temps nécessaire pour recevoir les résultats de séquençage nécessaires (pour l’identification des SNP), les analyses de séquence et l’ordre des amorces.

Le protocole présenté ici détaille les méthodes étape par étape pour des analyses réussies. L’une des étapes les plus critiques de ce processus est la conception appropriée des amorces. HRMA est suffisamment sensible pour que la présence d’un seul SNP dans le fragment amplifié puisse entraîner une courbe de différence forte qui pourrait être interprétée à tort comme une mutation. Le séquençage d’échantillons de colonies de laboratoire avant la mutagénèse CRISPR permet de détecter et d’éviter les régions riches en SNP lors de la conception de la cible; les amorces HRMA aideront à prévenir ce problème. La conception d’amorces pour petits amplicons (70-100 pb) peut également améliorer la sensibilité et la reproductibilité de l’expérience, car des fragments plus grands peuvent présenter plusieurs domaines de fusion, ce qui réduit les chances de distinguer les variantes22. Une limitation de la technique est qu’il pourrait ne pas être possible d’éviter complètement les SNP en fonction du gène; ainsi, le séquençage et l’utilisation ultérieure de plusieurs individus témoins de type sauvage peuvent faciliter les analyses.

Spécifiquement pour ce protocole, il est important de garder les moustiques génotypés en vie afin qu’ils puissent être recroquevillés pour l’établissement de lignées mutantes. Enlever l’une des pattes de moustique pour extraire l’ADNg peut être le moyen le moins invasif d’y parvenir; cependant, la quantité d’ADNg récupérée de ce tissu est minime. Le kit suggéré dans la table des matériaux était suffisant pour obtenir l’ADN d’une jambe de moustique et effectuer la PCR pour compléter HRMA.

HRMA peut offrir plus de flexibilité en termes de détection d’une large gamme de tailles d’indel, variant des incohérences à base unique à plusieurs paires de bases (AaeZIP11 avait une délétion de 56 pb) et surpassant les méthodes telles que le SNA ou le T7E1 (les deux tests de clivage d’incompatibilité enzymatique) qui sont limitées à l’inadéquation de base unique ou à de petites délétions (~ 20 pb)5, 23. De plus, le SNA ne détecte pas les mutants homozygotes car les produits de PCR ne contiennent pas d’incohérences. De plus, les résultats du SNA peuvent également être masqués par des polymorphismes alléliques naturels lorsque les produits de PCR traités par nucléase ont une longueur similaire à celle des allèles mutants. Aucune de ces limitations ne s’applique à HRMA. En fin de compte, le séquençage est nécessaire pour identifier la séquence d’ADN mutant. Cependant, une fois qu’une mutation en question est connue, l’HRMA utilisé pour l’identification des individus mutants est beaucoup plus rapide que le séquençage direct. Cette méthode préserve des échantillons précieux (plus les moustiques survivront, moins ils auront à attendre les résultats de leur génotype) et réduit le besoin de séquençage d’un grand nombre d’échantillons, réduisant ainsi le coût total de l’expérience.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Toutes les figurines ont été créées avec Biorender.com sous licence à la Texas A & M University. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (AI137112 et AI115138 à Z.N.A.), texas a & M AgriLife Research dans le cadre du programme de subventions pour les maladies tronquées par insectes et le national Institute of Food and Agriculture de l’USDA, projet Hatch 1018401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol 70% ethanol solution in water
96-well PCR and Real-time PCR plates VWR 82006-636 For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg)
96-well plate templates House-made printed, for genotype recording
Bio Rad CFX96 Bio Rad PCR machine with gradient and HRMA capabilities
Diversified Biotech reagent reservoirs VWR 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit New England Biolabs E1050S
Glass Petri Dish VWR 89001-246 150 mm x 20 mm
Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates Bio-rad HSP9665 For HRMA
Multi-channel pipettor (P10) Integra Biosciences 4721
Multi-channel pipettor (P300) Integra Biosciences 4723
Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific VWR 37000-548 To use with the 96-well  PCR plates for obtaining genomic DNA
Optical sealing tape Bio-rad 2239444 To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA
Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) Thermo Fisher F140WH For obtaining genomic DNA and performing PCR
Plastic Fly Vial Dividers Genesee 59-128W
Precision Melt Analysis Software Bio Rad 1845025 Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3)
SeqMan Pro DNAstar Lasergene software For multiple sequence alignment
Single-channel pipettor Gilson
Tweezers Dumont #5 11 cm WPI 14098
White foam plugs VWR 60882-189
Wide Drosophila Vials, Polystyrene Genesee 32-117
Wide Fly Vial Tray, Blue Genesee 59-164B

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References

  1. WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , Report No. 978 160 (2009).
  2. WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
  3. WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
  4. WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020).
  5. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  6. Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
  7. Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
  8. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
  9. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  10. Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
  11. Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
  12. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  13. O'Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
  14. Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
  15. Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  16. Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
  17. Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
  18. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
  19. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  20. Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  21. Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
  22. Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
  23. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).

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Génétique numéro 175
Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique <em>Aedes aegypti</em>
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Kojin, B. B., Tsujimoto, H., Jakes, E., O'Leary, S., Adelman, Z. N. Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (175), e63008, doi:10.3791/63008 (2021).

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